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lunes, 6 de enero de 2020

Combatir el fuego con el fuego



Si conoce a alguien que no se crea la teoría de la Evolución por Selección Natural de Darwin lo mejor que puede hacer es enseñarle el vídeo de arriba. Muestra como una bacteria como Escherichia coli es capaz de volverse resistente a un antibiótico en tan solo 11 días. En todas las poblaciones siempre hay mutantes. Y si hay una presión de selección en el medio ambiente, los que van a sobrevivir son aquellos que puedan aguantar esa presión. Y si sobrevives te reproduces, así que al final toda la población se vuelve resistente. Si se incrementa la concentración de antibiótico, el proceso puede volver a repetirse y volvemos a acabar con una población resistente.

Proceso que explica la aparición de resistentes que se ve en el vídeo del principio


No es la única forma de evolucionar que tienen las bacterias. En palabras de Ignacio Lopez-Goñi, las bacterias no tienen sexo, pero son muy promiscuas. Los fenómenos de transferencia horizontal (la transformación, la transducción y la conjugación) permiten que las bacterias puedan integrar información genética de otras bacterias. Si esa información genética codifica para un mecanismo de resistencia a los antibióticos, entonces se vuelven resistentes en un solo paso.



Bueno, pues esto es un problema para nosotros, porque estamos compitiendo contra la Selección Natural cuando queremos desarrollar nuevos antibióticos frente a las bacterias patógenas. Es una auténtica carrera de armamentos evolutiva: los humanos desarrollan un antibiótico frente al cual se desarrolla una resistencia, frente a la cual desarrollamos un nuevo antibiótico, frente al cual... etc. Y en este tipo de carrera parece que por ahora vamos perdiendo. ¿Se puede hacer algo para evitar quedarnos sin antibióticos?

Por ahora se han intentado diversos abordajes para intentar paliar dicha situación. Por ejemplo, buscar antibióticos para los cuales sea difícil que aparezca una resistencia. Predecir nuevos blancos moleculares y utilizar el llamado diseño racional de antibióticos. Sin embargo, los éxitos no han sido tantos como se esperaban. Así que todavía nos seguimos estrujando la cabeza para encontrar una solución al problema.

Kristofer Wollein Waldetoft, James Gurney, Joseph Lachance, Paul A. Hoskisson y Sam P. Brown proponen un nuevo abordaje: utilizar el propio proceso de la evolución bacteriana para generar nuevos antibióticos frente a las resistencias a los antibióticos. Para realizarlo proponen un nuevo procedimiento expetimental: el productor del antibiótico debe de competir por los recursos contra la bacteria objetivo en un medio estructurado. En la figura de abajo, el productor es de color y la bacteria objetivo es siempre de color negro. Teóricamente, si se consigue un mutante productor de un compuesto que mate a la bacteria negra, tendrá una ventaja selectiva. Si aparecen mutantes que sean mejores "asesinos" lo que debe pasar es que la densidad de la bacteria negra debe de disminuir en el tiempo. El sistema se debe de poder ajustar para tener mayores niveles de resistencia y así encontrar mejores productores de antibióticos.

Propuesta de diseño experimental para hacer evolucionar a productores de nuevos antibióticos. Más detalles en el texto. Origen de la imagen: Waldetoft et al


Los autores proponen un procedimiento y a su vez realizan una previsión de futuros problemas. En primer lugar se necesita usar un microoganismos cultivable y con un genoma que pueda dar lugar a una variación genotípica y fenotípica relevante. En primer lugar proponen usar sobre todo a miembros de las Actinobacterias, ya que hay precedentes de evolución de producción antibiótica en ese grupo y porque su genoma está lleno de clusters genómicos que codifican para posibles sustancias antimicrobianas. En segundo lugar, el microorganismo objetivo debe de tener un mecanismo de resistencia relevante y debe de interactuar antagónicamente con el productor. Las observaciones podrían verse favorecidas si ese microorganismo pudiese ser marcado con fluorescencia y si tuviese una temperatura máxima de crecimiento inferior a la del microorganismo productor. En tercer lugar se debe de utilizar un medio que permita las interacciones antagónicas entre el productor y el objetivo y que además no permita una fácil difusión de las células. Esto último podría permitir la evolución de la producción de "antibióticos por el bien común" entre diferentes agrupamientos celulares. Además, el soporte material del medio debería licuarse a una temperatura inferior a la temperatura máxima del microorganismo productor y solidificar por debajo de la temperatura del organismo objetivo.

¿Cómo funcionaría el sistema? En cuatro etapas.
1.- Se permitiría que el microorganismo productor se adaptara al medio y las condiciones de crecimiento sin la presencia del microorganismo objetivo
2.- Cocultivar al productor y al microorganismo objetivo. Medir la fluorescencia para determinar el nivel de inhibición en el crecimiento de este último
3.- Calentar o licuar el medio para matar a la bacteria objetivo pero no al productor. Agitar para romper los agrupamientos celulares y así mezclar la población de productores. Una alícuota conteniendo suficientes células del productor se debe de transferir para cocultivar con nueva bacteria objetivo. Se inicia así una nueva ronda de selección y se vuelve a medir de nuevo la fluorescencia.
4.- Si la disminución de fluorescencia es mayor que en la anterior etapa, analizar la población productora para encontrar qué es lo que ha producido esa mayor mortalidad (ejemplo: hiperproducción de una sustancia, nueva sustancia producida, etc.)

Sobre el papel pinta bien, pero pueden encontrarse con diversos problemas. Por ejemplo, que el microorganismo productor no se adapte bien al medio. O que aunque se produzca un antibiótico, se haga en condiciones subóptimas y no pueda ser detectado. O que los diferentes "mutantes" del productor compitan entre sí, antes de que compitan con el microorganismo objetivo. En total hacen referencia a una docena de posibles problemas. Pero algo me dice que más de un grupo de investigación se ha puesto a trabajar y pensar en como llevar a cabo ese diseño experimental o uno parecido. Ya veremos.

domingo, 8 de diciembre de 2019

Una simple decisión

Comportamiento de Stentor roeseli cuando se le incordia. Más detalles en el texto. Origen de la imagen: Phys.org
Cuando estudiaba la carrera de Biología decíamos que había dos tipos de biólogos: los de bata y los de bota. Ahora hay un tercer tipo: los de data. Y la historia que traigo trata sobre cómo un biólogo de data se tuvo que poner la bata para resolver un problema de un biólogo de bota.

En el año 1906 el zoólogo norteamericano Herbert Spencer Jennings realizó un experimento con el protozoo Stentor roeseli para ver cómo reaccionaba frente a un estímulo molesto. S. roeseli es un protozoo sésil, con forma de trompeta. En la parte estrecha tiene un pedúnculo de fijación, mientras que la parte ancha es la citoboca rodeada de cilios. Dichos cilios crean una corriente y así va atrapando bacterias u otros protozoos de los que se alimenta. El experimento de Jennings consistió en "incordiar" al pobre protozoo añadiendo partículas de carmín al agua con una micropipeta y observar lo que ocurría. Las partículas de carmín eran indigeribles, así que lo que hacía el protozoo era simplemente doblarse para alejarse de ellas. Si se continuaba añadiendo partículas lo que hacía S. roeseli era cambiar el sentido de rotación de los cilios de la citoboca para "escupir" las partículas y evitar ingerirlas. Pero si el estímulo molesto continuaba, entonces a S. roeseli se le "acababa la paciencia": primero se contraía y posteriormente se despegaba del sustrato al que estaba fijado y se iba nadando a otro sitio (ver la imagen superior).

Stentor roeseli. Fuente de la imagen: Wikipedia


El experimento de Jennigns mostraba que un organismo unicelular era capaz de realizar una escalada o jerarquía de comportamientos. Algo totalmente inesperado ya que se pensaba que eso solo podía ser realizado por organismos pluricelulares. Evidentemente, se trató de reproducir sus observaciones, pero no con mucho éxito. En 1967, se publicó un artículo que concluyó que todo debía de haber sido un artefacto, ya que lo que se observaba era que el protozoo se iba nadando en cuanto se añadía el estímulo molesto. No había una jerarquía de comportamientos.

La observación de Jennings habría quedado como una curiosidad para los historiadores de la Biología si no llega a ser por Jeremy Gunawardena, un biólogo de sistemas de la Harvard Medical School. Gunawardena oyó hablar de los experimentos de Jennings en un seminario del biólogo inglés Dennis Bray sobre el comportamiento de los protozoos. Se mostró sorprendido y fascinado por el hecho de que un ser unicelular tuviera ese nivel de autonomía. Así que se puso a revisar los trabajos de Jennings y de todos aquellos que habían intentado reproducirlo. Y se encontró con una sorpresa. El estudio de 1967 que refutaba a Jennings había sido realizado con el protozoo Stentor coeruleus. ¡Una especie distinta! No solo eso, S. coeruleus es una especie que prefiere nadar a permanecer fija en un sustrato, justo lo contrario a S. roeseli

Gunawardena se dispuso a intentar reproducir los experimentos de Jennings pero usando la especie correcta. Y aquí tuvo una pequeña dificultad. Su formación era matemática y su trabajo era sobre el procesamiento de datos moleculares dentro de un laboratorio de la facultad de Medicina. Así que cuando expuso su idea en los seminarios de grupo nadie se interesó en asuntos sobre "historia antigua y biología descriptiva". Afortunadamente, Sudhakaran Prabakaran, un postdoc colega suyo y el estudiante Joseph Dexter se interesaron con la idea y cuando terminaban su trabajo en los ordenadores, se ponían las batas para ver protozoos al microscopio. Diez años después han publicado sus resultados y han encontrado cosas muy interesantes.

Todos los comportamientos observados por Jennings para S. roeseli eran reproducibles, pero había gran variabilidad. Algunas células realizaban las cuatro fases: doblarse, "escupir", contraerse y soltarse. Pero otras simplemente se contraían y se soltaban. Y aquí es donde los tres volvieron a ser biólogos de datos. Al analizar los resultados de 57 experimentos encontraron que la mayor parte de las veces S. roeseli se doblaba o "escupía". Después se contraía y entonces debía decidir si permanecía fija o se soltaba y nadaba. Una vez se contraía, había un 50% de probabilidades de que S. roeseli permaneciera fija o se fuera nadando. El protozoo estaba "lanzando una moneda al aire". Según Gunawardena esta impredicibilidad es una ventaja que permite a estos protozoos distinguir entre lo que hay que evitar o lo que hay que comer.

Jerarquía de comportamientos de S. roeseli. A la izquierda se presenta en estado de reposo. Puede observarse a la derecha de cada fotografía la boca de la pipeta por donde se añade el agente irritante. El estado de "doblar y escupir" no se observa en todas las ocasiones. En el estado de "contracción" la célula debe de tomar la decisión de si continua en el sitio o se despega y nada. La flecha negra indica que esa decisión es irreversible. Figura realizada a partir del vídeo suplementario del artículo de J.P. Dexter, S. Prabakaran y J. Gunawardena.


Este sería uno de los sistemas biológicos más simples con capacidad de "tomar una decisión" (No es el sistema más simple porque creo que ese honor le corresponde al fago lambda y su decisión entre lisis y lisogenia) Según los autores este resultado puede tener diversas consecuencias en otros campos de la biología celular ya que muestra que las células no solo cumplen un "programa" genético, sino que también tienen una cierta autonomía y pueden tomar decisiones después de procesar la información de su entorno. Y además también muestra que a veces se pueden hacer grandes avances haciendo observaciones al viejo estilo, pero analizándolas con las técnicas modernas.

domingo, 17 de noviembre de 2019

¿Comeremos metano en el futuro?



Si es un fan de la Ciencia-Ficción seguro que conoce la película "Soylent Green" (aquí se tituló "Cuando el destino nos alcance"). Si no lo es, le recomiendo que la vea si tiene ocasión. En el año 2022 el mundo estará superpoblado y nos alimentaremos a base de unas galletitas nutritivas que producirá la compañía "Soylent". Esas galletitas están hechas a base de microorganismos y sazonadas con un ingrediente especial.

La película está inspirada en una novela escrita en 1966 en la que se describe ese mundo superpoblado. Cuando la MGM compró los derechos le dio carta blanca al guionista Stanley R. Greenberg para crear una distopía completamente distinta y mucho más desasosegante. En los años 70 del pasado siglo una de los temas recurrentes era la respuesta a la pregunta ¿Cómo vamos a alimentar a tanta gente? Y una de las respuestas era la producción de proteína unicelular o SCP (por Single Cell Protein). O en otras palabras: comer microbios. La idea no es tan extraña como puede parecer a primera vista. De hecho, ya comemos microbios cuando nos tomamos un yogur. La pequeña diferencia reside en que en lugar de usar leche para crecer microbios, lo que se pensaba usar era petróleo o alguno de sus productos derivados.

La británica ICI (Imperial Chemical Industries) fue la primera compañía en poner en práctica dicha idea. El microorganismos utilizado fue la bacteria Methylophilus methylotropha, y la fuente de carbono sería el metanol producido como subproducto en las refinerías de pteróleo. Se diseñó el fermentador más grande del mundo para la producción a gran escala. Era un fermentador de vaina hundida con un volumen de trabajo de 1.000 m3 (1.000.000 de litros). El producto fue bautizado como Pruteen y tenía una composición nutricional muy buena (más de un 70% del peso seco era proteína). Sin embargo, cuando se consiguió establecer la producción en el año 1980, no pudo competir económicamente con la soja. La tonelada de Pruteen costaba 600 dólares, mientras que la soja costaba como máximo 190 dólares. Así que la fábrica quebró y fue demolida en 1988.



Pero la idea de la SCP no ha muerto, solo se ha transformado. Hay un par de compañías que han puesto a punto plantas piloto para producir SCP a partir de metano, otro subproducto de la producción del petróleo. Cada año se queman 140.000 millones de metros cúbicos de metano en esas instalaciones (un 30% del consumo de gas natural de la Unión Europea). Así que la idea es utilizar ese metano para dar de comer a la bacteria metanotrofa Methylococcus capsulatus. Luego lo que hay que hacer es procesar a la bacteria y convertirla en pienso para el ganado o para peces. Como he apuntado antes hay dos compañías que están desarrollando la idea. Una es la norteamericana Calysta, y la otra la compañía danesa Unibio. Esta última parece que ha conseguido financiación para pasar de planta piloto a planta industrial. La primera factoría parece que se va a establecer en Rusia, pero tienen planes de poner otra en los Estados Unidos.

La compañía Unibio utiliza un fermentador en bucle impulsado por inyección de gas conocido en inglés como U-loop Fermenter (parece que Calysta también usa un biorreactor parecido, pero en su web no dan detalles de ello). El U-loop Fermentor tiene un diseño ingenieril peculiar (ver la figura de abajo). El fermentador está enterrado, pues de esa forma las paredes pueden aguantar la presión interna debida a la inyección de gas natural y de oxígeno. En el fermentador además hay que inyectar sales minerales y una fuente de nitrógeno (puede ser amonio gaseoso) (5). Es un cultivo en crecimiento continuo que debe mantenerse a 45ºC de temperatura gracias a un intercambiador de calor (7). En un cultivo continuo está entrando un flujo constante de nutrientes (5) y por otro lado se está retirando el mismo volumen de cultivo con biomasa bacteriana (2). La parte superior del fermentador es un depósito de gran volumen que está parcialmente lleno para actuar como cámara de desgasificación (1) que permite que el CO2 producido pueda ser liberado (3). En esa cámara está también la salida del medio conteniendo microorganismos (2). La impulsión del fluido no solo es por la inyección del gas, también tiene incorporado una bomba que impulsa el fluido hacia la cámara de desgasificación (el punto 4 es el motor y el punto 6 es la turbina de impulsión). Adicionalmente, tiene una serie de deflectores internos en espiral que permiten la correcta mezcla de las fases gaseosas, los nutrientes adicionales y las bacterias (8). El tamaño del fermentador de la planta piloto es de 50 m3 y puede llegar a producir 4 kilogramos de biomasa por metro cúbico y por hora.

Esquema del U-loop Fermenter de la compañía Unibio. La explicación del funcionamiento está en el texto


El cultivo con la biomasa bacteriana se centrifuga para concentrar las células y posteriormente se las somete a un proceso de ruptura. El extracto pasa a una unidad de secado por espray de aire caliente. De esa forma se consiguen gránulos de proteína unicelular con un contenido de un 72,9% de proteína. La compañía ha bautizado a este producto con el nombre de UniProtein.

El aspecto final del producto UniProtein. Fuente de la imagen: Unibio


Como he indicado antes, el Uniprotein es para piensos, pero quién sabe. Quizás en un futuro vendan galletitas con el nombre de Unisoylent.

domingo, 3 de noviembre de 2019

Domesticando microbios

Las consecuencias de la domesticación. Origen de la imagen: Finofilipino.


Hace unos 15.000 años los humanos comenzamos a domesticar a una especie de lobo gris (Canis lupus) y la transformamos en perro (Canis familiaris). Es muy probable que hace 23.000 años comenzáramos la proto-domesticación de algunas plantas. La transformación de una especie silvestre en una especie domesticada es algo relativamente sencillo. Lo único que tienes que hacer es controlar la reproducción y escoger las características que más te interesa que se perpetúen en la especie que vayas a domesticar. Si esas características son heredables poco a poco se irán fijando en la población domesticada. Al mismo tiempo, la población silvestre irá disminuyendo. La fijación de las características heredables parece que es mucho más rápida cuando se trata de domesticar animales que en las plantas. Es probable que sea porque el "aislamiento genético" necesario para la especiación es más fácil de conseguir con un animal que con una planta. En 1958 el biólogo ruso Dmitri Beliáyev realizó el llamado "experimento de domesticación del zorro". Lo que hizo fue tomar una población de zorros (Vulpes vulpes) y seleccionó para su cría a aquellos zorros que mostraban más miedo hacia los humanos. Luego volvía repetir la selección con los descendientes. Solo dejaba reproducirse a un 10% de cada generación creando lo que se conoce como "cuello de botella" genético. En la cuarta generación los zorros ya meneaban la cola al ver a un humano. En la sexta generación ya había cachorros que gemían de alegría al ver a un humano y se acercaban a lamer las manos a la manera de un perro doméstico. A lo largo del experimento, que aún continua, 10.500 zorros han sido usados como progenitores y 50.000 cachorros han sido examinados por su carácter domesticable. Los cambios genéticos observados afectan sobre todo a la reducción de los niveles de hormonas como la adrenalina y el cortisol (Actualización. Recientemente este experimento ha sido puesto en entredicho. Más información en este enlace).

Pues bien, los humanos hicimos algo parecido con los microbios, aunque no fuéramos conscientes de ello. Hace unos 15.000 años, en una zona de Oriente Medio (ver mapa) apareció la cultura preneolítica conocida como Natufiense. Hay evidencias que muestran que dicha cultura ya elaboraba pan hace 14.400 años. Ese pan era elaborado a partir de un triturado de diversas gramíneas junto con otros vegetales. Luego ese harina se mezclaba con agua y se elaboraba una masa con la que hacían una especie de tortas que calentaban en un fuego. Desconocemos si en la elaboración de ese pan se dejaba fermentar la masa antes de ser cocida pero, 1000 años después, alguien de la misma cultura que habitaba la cueva israelí de Raqefet, ya había aprendido a germinar los granos de cereal para después tostarlos, molerlos, mezclarlos con agua y dejarlos fermentar. Es decir, alguien había comenzado a elaborar cerveza siendo la primera prueba arqueológica de la domesticación de los microbios.

La cultura Natufiense, el pan y la cerveza. El mapa de la izquierda muestra los principales asentamientos de dicha cultura (origen de la imagen, Wikipedia). En el centro se muestra el hogar donde se han encontrado restos de cocción del pan (excavación de Shubayqa, cerca de Wadi Uwainid. Origen de la imagen, Arranz-Otaegui et al.). A la derecha los morteros hechos con rocas utilizados para almacenar grano y los morteros en roca utilizados para machacar dichos granos y elaborar cerveza (excavación de la cueva de Raqefet, cerca de El Wad. Origen de la imagen, Liu et al.).  


Nuestros antepasados eran antiguos pero no tontos. Si elaboraban cerveza eso implica que conocían que el proceso de fermentación era reproducible. Así que no es difícil imaginar que si les salía una partida de cerveza con un sabor mejor que el de otra partida de cerveza, seguramente utilizarían la primera como inóculo de las siguientes fermentaciones. Pero aquí hay una diferencia con respecto a las plantas o los animales. No podían aislar a un solo microorganismo, lo que aislaban era a un conjunto de ellos. Sin embargo, consiguieron crear un "cuello de botella" ya que lo que seleccionaron eran comunidades microbianas que crecían de manera óptima en el caldo de cultivo consistente en el cereal malteado y cocido en agua. En esas condiciones los microbios que más prosperan son las levaduras, ya que son capaces de crecer en medios con altas concentraciones de azúcar, con poco oxígeno y con presencia de alcohol. Seguramente, los antiguos debieron notar que algunas cervezas les ponían más "contentos" que otras, porque la resistencia al alcohol parece que es uno de los caracteres que fue seleccionado durante este proceso de domesticación.

En el año 2016 el grupo de Kevin J. Verstrepen realizó el primer análisis filogenético de cepas domesticadas de Saccharomyces cerevisiae. Su análisis se vio complementado en el año 2018 por el grupo de Feng Yan Bai, que analizó 106 cepas silvestres y 166 cepas industriales. En ese análisis concluyó que el ancestro común de todas las cepas de S. cerevisiae proviene del Lejano Oriente. En una reciente revisión aparece publicado un árbol filogenético con todas las cepas analizadas hasta el momento. Lo que muestra es que hay dos ramas con levaduras domesticadas: la rama asiática con levaduras especializadas en fermentaciones sobre sustrato sólido, y la rama europea, con levaduras especializadas en las fermentaciones líquidas. Aún no se sabe si las levaduras fueron primero domesticadas en Asia y desde allí se extendieron al resto del mundo, o si por el contrario la domesticación fue realizada de manera independiente en Europa y Asia. ¿Por qué no se sabe? Pues porque precisamente faltan por analizar muestras de cepas de levaduras industriales originarias de zonas del Oriente Medio (no sé si algún grupo lo está llevando a cabo o si esa falta se debe a que no existen. Recordemos que en el Islam las bebidas fermentadas están prohibidas).

Árbol filogenético de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La rama verde de la derecha son las cepas silvestres. La rama naranja son las cepas industriales asiáticas, que son usadas sobre todo para hacer pan. La rama roja son los aislados industriales europeos, que se utilizan principalmente en la elaboración de bebidas alcohólicas. Dentro de esa rama hay dos anomalías. El primero son las de cepas silvestres aisladas de la encina (mediterranean oak) que está relacionado con las levaduras del vino. Se piensa que su origen está en un "asilvestramiento" de las levaduras vínicas. El segundo es más extraño. Es el cluster de levaduras usadas en las fermentaciones lácticas en la zona de Mongolia. ¿Las habrá llevado de vuelta un conquistador mongol desde Europa hasta las estepas asiáticas? Confiemos en que futuros análisis despejarán ambos enigmas. Origen de la imagen: Steensels et al. 2019


En esa misma revisión se habla de los diversos procesos biológicos implicados en la domesticación de los microorganismos usados en la industria. Hay cambios genéticos como la pérdida de genes o la decadencia del tamaño del genoma. También se han encontrado hibridaciones interespecíficas (recordemos aquí el origen de la levadura S.pastorianus), transferencias genéticas horizontales, aneuploidía, recombinaciones cromosómicas. Por ejemplo, las levadura vínicas tienen una alta resistencia al cobre, algo lógico si tenemos en cuenta que el sulfatado de las cepas era una práctica habitual en la viticultura. En el caso de las levadura cerveceras se ha encontrado que tienen aumentada su capacidad de metabolizar la maltotriosa y que tienen duplicados los genes MAL, una adaptación para aprovechar eficazmente los azúcares provenientes del almidón de los cereales. En los lactobacilos se ha encontrado que han perdido capacidades para biosintetizar aminoácidos pero a cambio tienen genes para lactasas y proteasas adquiridos por transferencia horizontal. Lo mismo ha ocurrido con los genes para amilasas codificados por el hongo Aspergillus oryzae, utilizado en el procesamiento del arroz para así producir sake. Confío en que gracias a las nuevas técnicas analíticas, tanto en el campo de la arqueología como en el campo de la filogenia molecular, vamos a ir rellenando más y más huecos sobre la relación histórica entre los humanos y los microbios.

Consecuencias de la domesticación de la levadura
Meme generado usando imágenes sin copyright de la Wikipedia


Recientemente, la revista "Trends in Genetics" ha escogido a Saccharomyces cerevisiae como genoma del mes.

Mi agradecimiento a Dani Torregrosa (@DaniEPAP) por sus ánimos para que retomase el blog. Espero ser más constante esta vez.

viernes, 17 de mayo de 2019

Hijos de Loki

El superfilo arqueano de Asgard


En la mitología escandinava Loki es el señor del caos. Es astuto y siempre intenta engañar o hacer daño a los otros dioses, aunque sus fechorías generalmente tienen arreglo - por ejemplo, le cortó las trenzas a Sif, la esposa de Thor, pero éste obligó a Loki a que las sustituyera por cabellos de oro trenzados por nibelungos. Pues bien, parece que el dios escandinavo está haciendo de las suyas en el terreno de la taxonomía bacteriana, y podría decirse que incluso ha hecho acto de presencia.

Ya hemos comentado en el blog que el llamado árbol de la vida está en constante revisión gracias a los numerosos estudios metagenómicos que se están realizando sobre las diversas comunidades microbianas del planeta. En el año 2015 el grupo liderado por Thijs Ettema analizó unos sedimentos provenientes de la chimenea hidrotermal conocida como "Castillo de Loki" en las profundidades del Océano Ártico. Allí encontraron unas secuencias que pertenecían a un nuevo filo de arqueas que fueron bautizadas convenientemente como Lokiarchaeota. Poco a poco se fueron encontrando otros filos relacionados y que fueron bautizados como Thorarchaeota, Odinarchaeota y Heimdallarchaeota. Como era de esperar al superfilo se le conoce como Asgard.

¿Y cuál es la importancia de este superfilo? Pues porque sus datos parecen apoyar la hipótesis del árbol con dos dominios de la vida (Bacteria y Archaea) parece que poco a poco se va imponiendo sobre la visión del árbol de los tres dominios (Bacteria, Archaea y Eukarya). Y si esos datos se confirman entonces todos los ecuariotas - desde los protozoos hasta nosotros, incluyendo plantas y hongos - se habrían originado a partir de los Lokiarchaeotas. A nivel de la Biología esto es como si te dijeran que John Snow no es el sobrino de la Khalessi, sino su tío. La interpretación de los datos metagenómicos que hacen en el grupo de Thijs Ettema les lleva a proponer un modelo de "flujo reverso" para explicar el origen de la endosimbiosis que dio lugar a los eucariotas. Veamos qué significa esto. Hasta ahora la hipótesis más aceptada para la endosimbiosis es la de que una antigua archaea con metabolismo anaerobio "integró" una bacteria capaz de metabolizar el oxígeno. Esta nueva quimera tendría una ventaja energética que le permitiría desarrollar una fisiología celular mucho más compleja. Pero el modelo de "flujo reverso" propone que el hospedador organotrófico arqueano se alimentaba de compuestos orgánicos y que sus desechos proporcionaban un flujo de electrones o de hidrógeno a su simbionte bacteriano que para aprovecharlos totalmente usaba el oxígeno como aceptor final de sus rutas metabólicas. Este tipo de asociaciones metabólicas entre dos microorganismos, en el que el desecho de uno es la comida del otro, no son raras en la naturaleza (se conoce como sintrofía), y ésta debió derivar hasta una interacción tan íntima que se fusionaron ambas células.

Árbol filogenético basado en el análisis de 52 genes presentes en 144 taxas. Los Eucariotas aparecen más cercanos a las Heimdallarqueotas que a cualquier otro grupo. Fuente de la imagen: Spang et al 2019


Como suele pasar con todas las hipótesis científicas hay gente que se la cree y otros que no están convencidos en absoluto. El laboratorio de Patrick Forterre pertenece precisamente a ese grupo y han publicado un artículo refutando este modelo endosimbióntico afirmando que las muestras analizadas por el grupo de Ettema están contaminadas con genes eucariotas y que por ello sus árboles filogenéticos son producto de un artefacto. Para Forterre el árbol de la vida sigue teniendo tres ramas. Y en su apoyo ha acudido el microbiólogo Norman Pace, uno de los popes de la taxonomía bacteriana, que ha llegado a afirmar que algunos de los métodos estadísticos usados por Ettema son una "asunción estúpida". Lo dicho, Loki está haciendo de las suyas.

Pero afortunadamente en Ciencia lo del principio de autoridad no suele ser muy válido y por lo que se ve son más los científicos que creen que las evidencias que se van acumulando parecen favorecer el modelo de Ettema a los otros modelos. Esas evidencias no están basadas solo en el análisis metagenómico de secuencias. Ya comentamos en el blog que se miran otras cosas como por ejemplo la presencia de los llamados core-genes para la producción de proteínas, los genes que codifican para proteínas del citoesqueleto, o la organización y composición de las membranas biológicas. Este último aspecto que es conocido como la "división lipídica" es el que más apoya el árbol de tres ramas, ya que las membranas de bacterias y eucariotas son más parecidas entre si, que las membranas de arqueas y eucariotas. Pero resulta que la biología sintética ha venido a cerrar esa división lipídica. El año pasado el grupo holandés liderado por Arnold J. M. Driessen y John van der Oostc consiguieron "convertir" a la bacteria Escherichia coli en una arqueobacteria en lo que a su composición de membranas se refiere. Además, recientemente se han encontrado bacterias que son capaces de sintetizar lípidos arqueanos de manera natural.

¿Qué va a hacer falta para determinar quién tiene razón? Pues probablemente que alguien consiga crecer a una arquea asgardiana en el laboratario, preferentemente una Heimdallarqueota, pues parece que es el filo más cercano a los eucariotas según los últimos datos. Una vez aislada y crecida se podrá analizar y experimentar con ella. Por ahora lo que hay son imágenes de fluorescencia realizadas sobre muestras ambientales. Y lo que ha llamado la atención es que las células asgardianas tienen su ADN condensado en el centro de la célula, como si fuera un ¿núcleo? Estoy convencido que la saga asgardiana nos va a dar más de una sorpresa en los próximos años.

Heimdalarqueotas del Mar Negro marcadas con fluorescencia. En a se muestra la superposición de las imágenes b y c. La imagen b es la tinción con DAPI que tiñe el DNA. La imagen c es un CARD-FISH que tiñe las proteínas. Fuente de la imagen: Salcher et al. 2019


Bibliografía:

lunes, 13 de mayo de 2019

Terapia con fagos ¿a la centésima va la vencida?

Si le gusta la microbiología seguramente habrá oído hablar de la película "El doctor Arrowsmith". Dirigida en 1931 por John Ford, adapta la novela homónima escrita en 1925 por el premio Nobel Sinclair Lewis. Entre las distintas vicisitudes que le ocurren al microbiólogo protagonista está el descubrimiento de un bacteriófago que elimina las bacterias de forma rápida y eficaz, por lo que podría ser usado como una nueva terapia contra las infecciones bacterianas. Sin embargo su alegría se ve empañada cuando su mentor le informa que en Francia, el investigador Felix d’Herelle se le ha adelantado y ya ha publicado el mismo descubrimiento.


Entrada publicada en el blog Microbichitos. Para continuar leyendo clickea aquí.

sábado, 9 de marzo de 2019

La lógica del Cello



Poco a poco la Biología Sintética está tomando cuerpo como una disciplina que se va a poner al mismo nivel que la Bioquímica, la Genética o la Microbiología. Aunque algunos la han definido como una especie de Ingeniería Genética 2.0 en realidad la Biología Sintética es mucho más que eso. Podría ser definida como el uso de los principios de la Ingeniería para entender, diseñar y ensamblar componentes biológicos y conseguir nuevas utilidades y/o propiedades (*). Uno de los campos con mayor proyección es el desarrollo de circuitos genéticos para la programación celular. Hay que tener en cuenta que cualquier célula es capaz de tomar decisiones para responder a los cambios en su medio ambiente. Esa capacidad existe gracias a que las células poseen una serie de rutas que regulan el comportamiento de genes y proteínas. Ejemplo, si Escherichia coli detecta que hay lactosa en el medio activará la expresión de los genes que codifican para las enzimas necesarias para metabolizar ese azúcar. Es lo que conocemos como el operon lac, un circuito genético que ha sido desarrollado por la Evolución biológica.



Desde hace tiempo tenemos la capacidad tecnológica de construir circuitos genéticos para que las células respondan a las señales que nosotros pongamos en su entorno y así generar la respuesta metabólica que nosotros deseemos. Es decir, podemos rediseñar los sistemas biológicos naturales ya existentes para que hagan algo útil que nosotros queramos. Un paso más en la revolución biotecnológica actual. Evidentemente el primer paso para construir un circuito genético es diseñarlo. Hay varias formas de hacerlo pero una de las más sencillas es la descrita por el grupo liderado por Christopher A. Voight. En el 2016 publicó el artículo “Genetic circuit design automation” (DOI: 10.1126/science.aac7341) en el que se describía la web Cello (www.cellocad.org). Esta web es un entorno virtual en el que se aplican los principios del diseño de circuitos electrónicos basados en la lógica booleana para generar circuitos genéticos. Para ello usa un lenguaje de programación usado por los ingenieros electrónicos, el lenguaje Verilog, para el diseño de puertas lógicas del tipo NOT/NOR. Ese tipo de puertas lógicas tiene su equivalente biológico en los sistemas de proteínas represoras/activadoras de la transcripción. En el artículo además describían el desarrollo de una librería de "biobricks" que representaban a esas puertas lógicas y que podían ser interconectadas para formar el circuito genético que quisiéramos. Una vez diseñado el circuito genético el entorno Cello te proporciona la secuencia de DNA completa de dicho circuito, cómo debe diseñarse el plásmido donde clonar el circuito, los resultados esperados en el nivel de expresión de la proteína actuadora por número de células, etc. Todo listo para clonar en E. coli y que el circuito funcione. En el siguiente vídeo el propio Christopher A. Voight explica con detalle lo que hicieron.



Pues bien, este año he considerado que había que introducir algo más de Biología Sintética en el temario de la asignatura de Microbiología Industrial que se imparte en 2º curso del grado de Biotecnología de la UMH. Así que decidí que aprender a usar el entorno Cello podía ser una práctica de informática bastante interesante. Los resultados de la experiencia está comentada en el blog de la asignatura, aquí lo que voy a comentar es cómo me he manejado con dicho entorno y cuál es su potencial como herramienta para diseñar circuitos genéticos.

Como he dicho antes el entorno Cello utiliza el lenguaje de programación Verilog, y si uno se mira algo de dicho lenguaje lo primero que piensa es que no va a poder entenderlo. Sin embargo es más sencillo de lo que parece ya que en realidad los circuitos biológicos no son tan variados como los circuitos electrónicos así que uno puede hacerse unas "plantillas" con los programas que vienen descritos en el artículo de Voight (más abajo he puesto dos ejemplos). En dicho artículo se describen 45 circuitos genéticos distintos que han comprobado que funcionan in vivo. Lo siguiente que tiene que hacer el usuario de Cello es establecer las condiciones previas (en el entorno Cello se denominan UCF por “user constraints file”) como son el tipo de microorganismo que se va a usar, qué tipo de sensores va a disponer - ej: presencia/ausencia de arabinosa - y finalmente qué tipo de “actuador” - ej: expresión de Proteína Verde Fluorescente - está bajo el control del circuito genético que va a diseñarse. Una vez establecidas estas condiciones previas, se debe de establecer la llamada “tabla de la verdad” del circuito lógico. Esa tabla se introduce en la plantilla Verilog que le corresponda. Una vez hecho esto, el entorno Cello diseña automáticamente la secuencia de DNA que codifica para el circuito deseado. También hay que decir los problemas. El primero es que el servidor es bastante lento (lo cual es un problema para la realización de una práctica). El segundo es que el correo de asistencia técnica no funciona (o al menos a mí nunca me han respondido).

El trabajo del grupo de Voight no es interesante solo por el hecho de haber desarrollado el entorno Cello. Lo más interesante es que han conseguido aislar cada una de las "puertas lógicas genéticas" para que no se produzcan cortocircuitos. En un circuito electrónico es fácil aislar los diodos y los resistores y construir el circuito en dos dimensiones. La electricidad recorre el material conductor y ya está. Pero en los circuitos genéticos todos los componentes están en una dimensión y están hechos del mismo material (DNA y proteínas). En un ser vivo las señales de entrada/salida (inputs/outputs) no son electrones, son flujos de la RNA polimerasa. T las puertas lógicas NOT/NOR no son diodos o resistores, son genes, promotores, proteínas represoras, secuencias de unión de ribosomas, y se aíslan entre si gracias a terminadores de transcripción fuertes. De esa forma se puede intercambiar entre sí y así construir circuitos complejos. Algunos de ellos están compuestos por 10 reguladores y 55 partes y su funcionalidad es del 92% de lo predicho.

La Puerta NOR representada con el símbolo ANSI de la esquina superior izquierda, es una puerta lógica que implementa la disyunción lógica negada. Esto quiere decir que se comporta de acuerdo a la tabla de verdad mostrada debajo de dicho símbolo. En la parte inferior izquierda se muestra la programación en Verilog de dicha puerta. Nótese como están codificadas las entradas y las salidas (por ejemplo la entrada  "0,0" y salida "1" es la línea 2'b00: {out} = 1'b1; ). En la parte central se representa el diagrama electrónico en la parte superior y la disposición física CMOS en un circuito integrado. A la derecha se representa el circuito genético completo que codifica para la puerta NOR. Hay dos genes sensores, los represores LacI y TetR (arriba), la puerta NOR que consiste en el gen del represor PhlF bajo el control de los promotores Ptac y Ptet (centro) y el gen actuador o reporter (debajo) que consiste en una proteína fluorescente controlada por el promotor PPhlF. Los símbolos que aparecen siguen la normativa SBOL. Más detalles del funcionamiento en el texto.La imagen es una composición realizada a partir de material de la Wikipedia, del artículo de Voight et al. y del resultado del programa Cello


Vamos a ver como se construye una puerta NOR con un circuito genético. En la imagen de arriba está representado el circuito. Como vemos en la tabla de la verdad, la puerta NOR da un resultado de "1" cuando no hay ninguna entrada. Si hay alguna entrada, entonces la salida es "0". En el circuito biológico, los genes sensores son los represores LacI y TetR. Como vemos se están expresando constitutivamente luego esas proteínas siempre están presentes. En la situación "0,0" significa que no hay ningún estímulo y ambos represores se unen a los promotores Ptac y Ptet, impidiendo la transcripción del gen phlF que codifica para la proteína represora PhlF. Si nos fijamos ahora, el gen de la proteína YPF (Yellow Fluorescent Protein) está bajo el control del promotor PPhlF. Como no está reprimido, entonces la proteína YPF se está expresando y la bacteria brillará con luz amarilla (salida "1"). ¿Qué ocurre si hay un estímulo o entrada (situación "1,0")? es decir ¿qué ocurre si hay IPTG? Pues que el represor LacI queda inactivado y el promotor Ptac ahora puede ser usado por la RNApolimerasa para expresar el gen PhlF (basta con que haya un promotor libre para que el gen se exprese). Como ahora hay proteína represora PhlF, ésta se une al promotor PPhlF impidiendo la expresión de la proteína YPF, con lo cual la bacteria no brillará con luz amarilla (salida "0"). Lo mismo ocurre si añadimos tetraciclina (situación "0,1"), o ambos estímulos (situación "1,1"). Esta puerta NOR ahora puede ser considerada como un "biobrick" funcional.

Lo que puede hacerse es ir conectando varias de dichas puertas lógicas e ir creando circuitos genéticos cada vez más complicados. Pero claro, hay que evitar que los diferentes componentes de los circuitos - recordemos que son DNA y proteínas - se estén estorbando entre sí ya que todos ellos están dentro de la sopa que es el citoplasma de la célula. Ese es precisamente el mayor mérito que tiene el trabajo del grupo de Voight. Que han diseñado 60 circuitos con distintos "biobricks" y que han comprobado que 45 de ellos funcionan de la manera esperada. Y los "biobricks" que forman dichos circuitos funcionales han sido almacenados en una librería que es la que usa Cello para diseñar los circuitos genéticos que nosotros introduzcamos.

Cómo usar Cello. El primer paso consiste en realizar el programa con la "tabla de verdad" del circuito lógico en lenguaje Verilog. Después se añaden las condiciones previas o UCFs (genes sensores, genes actuadores, cepa de E. coli). El entorno Cello construye dicho circuito y a su vez lo transforma en una secuencia de genes utilizando para ello los "biobricks" que tiene en su librería. El programa te realiza una predicción de los resultados esperados indicando en que condiciones las células emitirán fluorescencia o no (gráficas de la derecha, líneas azules y rojas).Ahora solo queda construir el plásmido que lleva ese circuito e introducirlo en una cepa de E. coli que ya lleva los genes sensores y el gen actuador. El siguiente paso sería comprobar que efectivamente eso es lo que sucede al poner a dicha cepa de E. coli en las condiciones especificadas y ver si emite fluorescencia o no (gráficas de la derecha, curvas sólidas negras). Imagen realizada a partir de las figuras en el artículo de Voight et al.


Este trabajo permite simplificar el desarrollo de una manipulación de las redes genéticas basada en módulos. Es un gran avance, pero hay más cosas a tener en cuenta. Hace poco Victor de Lorenzo comentó en Twitter que uno de los cuellos de botella de la Biología Sintética es la implementación in vivo de este tipo de circuitos complejos es la mutación y la evolución. Recordemos que lo que estamos haciendo es manipular a un ser vivo para que haga algo que nosotros queremos, no para que ese ser vivo haga algo que le permita sobrevivir y reproducirse. Un circuito integrado de una placa base no muta o evoluciona. Siempre va a ser un semiconductor en una placa de plástico. En un ser vivo, la mutación y la evolución pueden alterar esos circuitos genéticos, sobre todo cuanto más complejos sean, de forma tal que al final la evolución nos va a derrotar y vamos a perder esa información que hemos introducido. Quizás una forma de evitar el problema sea usar "sistemas libres de células". Otra posible solución sea que algún ingeniero bioquímico diseñe una DNA-polimerasa hipermejorada que tenga una tasa de error inferior a la de 1 error por cada 10.000 nucleótidos (o mejorar todo el sistema enzimático dedicado a evitar los errores de copia) y usar esa hiiperDNApol en un chasis celular diseñado exclusivamente para alojar ese tipo de enzima. Lo cierto es que esto es una paradoja biotecnológica. La mutación y la evolución pueden ser el mejor amigo de la biotecnología ya que permite el desarrollo de nuevos caracteres o habilidades biológicas (ver simplemente el premio Nobel de Química de este año). Pero también es el peor enemigo de la biotecnología porque causa la pérdida de esas habilidades. Ya veremos que nos depara el futuro.

(*)Hay una serie de vídeos realizados por el EMBL sobre Biología Sintética en los que se pueden explorar los diversos campos en los que esta disciplina está involucrada

Plantillas para módulos de Cello.

Como he dicho más arriba, aquí dejo unas plantillas para diseñar módulos que puedan ser usados el entorno Cello. Basta sustituir el valor de los "0" por los valores de la tabla de verdad que deseamos para nuestro circuito (en la puerta NOR sería 1,0,0,0), copiar el programa y pegarlo en la ventana de Cello. También puede cambiarse la "A" por el nombre del módulo con el que queramos bautizar al programa (por ejemplo module NOR). He puesto dos plantillas .

Plantilla: 2 entradas, 1 salida

module A(output out1, input in1, in2);
always@(in1, in2)
begin
case({in1,in2})
2'b00: {out} = 1'b0;
2'b01: {out} = 1'b0;
2'b10: {out} = 1'b0;
2'b11: {out} = 1'b0;
endcase
end
endmodule


Plantilla: 3 entradas, 1 salida

module A(output out1, input in1, in2, in3);
always@(in1,in2,in3)
begin
case({in1,in2,in3})
3'b000: {out1} = 1'b0;
3'b001: {out1} = 1'b0;
3'b010: {out1} = 1'b0;
3'b011: {out1} = 1'b0;
3'b100: {out1} = 1'b0;
3'b101: {out1} = 1'b0;
3'b110: {out1} = 1'b0;
3'b111: {out1} = 1'b0;
endcase
end
endmodule