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jueves, 25 de septiembre de 2014

Campos magnéticos para diagnosticar la malaria



Un aspecto crucial de la lucha contra la malaria es la diagnosis de la enfermedad. Hasta ahora, la técnica estándar usada para determinar si una persona sufre dicha enfermedad consiste en tomar una muestra de sangre y observarla bajo el microscopio para ver si el trofozoíto de Plasmodium falciparum está presente en el interior de los glóbulos rojos. Lo malo es que este procedimiento es caro y lento, ya que requiere que las muestras deban ser procesadas y observadas por un técnico muy bien entrenado en un laboratorio con un buen microscopio. Además, cuanto más temprano sea el diagnóstico, mejor tratamiento se puede dar a la persona afectada. Pero en la fase temprana puede haber entre 5 a 10 trofozoítos por microlitro de sangre, y si un microlitro tiene entre 4 a 5 millones de glóbulos rojos nos podemos hacer una idea de lo difícil que es pillar a esos pequeños HdP. De hecho, generalmente cuando se diagnostica la enfermedad los niveles alcanzados suelen ser de unos 50 trofozoítos por microlitro de sangre y el paciente ya está desarrollando lo síntomas característicos.

Izquierda: Muestra de sangre en el que puede observarse un trofozoíto en el interior de un glóbulo rojo (origen de la imagen: Wikipedia). Derecha: ciclo del Plasmodium en el interior de los glóbulos rojos (Fuente de la imagen: CDC)


No es de extrañar que haya mucho interés en desarrollar un método rápido, barato y sencillo para diagnosticar la malaria. Como es lógico más de un grupo ha intentado desarrollar algún kit de diagnóstico basado en algún tipo de técnica de Biología Molecular o en un ensayo inmunológico. Pero todos los desarrollados hasta el momento son caros y no tan sensibles como se esperaba. El umbral de detección está en torno a los 100 trofozoítos por microlitro, el doble de los niveles detectables por un buen técnico. Afortunadamente la Física y la Química han venido en ayuda de la Microbiología Clínica.

En el año 2012 un grupo búlgaro liderado por I. Kezsmarki describió un método basado en la detección de un metabolito generado por el parásito cuando digiere a los glóbulos rojos desde dentro. Los hematíes son fundamentalmente bolsas de hemoglobina, y P. falciparum la digiere para así obtener aminoácidos. Al destruir la hemoglobina, se libera el grupo hemo acomplejado con el hierro. Pero el grupo hemo es un compuesto bastante tóxico que podría destruir al parásito. Así que lo que hace P. falciparum es transformarlo en hemozoína, un compuesto insoluble que precipita formando unos cristales cilíndricos de color marrón debido al hierro que contienen.

A: Estructura de la hemozoína. Los grupos hematina interaccionan entre sí gracias a una serie de enlaces de hidrógeno formando una estructura cristalina. B: Cristal de hemozoína producido por P. falciparum. C: Cristales de hemozoína bajo la luz polarizada. D: Un glóbulo rojo invadido por P. falciparum. En la parte de la izquierda puede observarse un cuerpo residual de color marrón que está compuesto por cristales de hemozoína. Fuente de las imágenes: Wikipedia


Los investigadores bulgaros pensaron acertadamente que dichos cristales debían de comportarse como unos pequeños imanes y que podrían ser detectados mediante el uso de un campo magnético. Cuando la sangre de un infectado por malaria se ponía bajo la acción de un campo magnético oscilante, estos cristales comenzaban a girar y se ordenaban sobreponiéndose a las perturbaciones térmicas. Además, estos cristales son anisotropos, por lo que actúan como unos polarizadores de la luz, lo cual permite que se puedan detectar de manera bastante precisa . Ventaja de este procedimiento: se detectaban hasta 10 trofozoítos por microlitro. Desventaja: se necesitaba un aparato de Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (la conocida como NMR) tremendamente cara y grande acompañada de un técnico entrenado.

Cristales de hemozoína sometidos a un campo magnético oscilante. En (a) los cristales están en suspensión y el campo magnético es nulo (B=0). Si se les somete a un campo magnético (b y c), los cristales se alinean, pero debido a las fluctuaciones térmicas el alineamiento se acaba perdiendo. Si se hace oscilar el campo magnético (d y e)  los cristales de hemozoína comienzan a rotar, con lo que se consigue contrarrestar el efecto de las fluctuaciones térmicas y al final los cristales quedan alineados. Fuente de la imagen: Butikay et al. Scientific Reports


Pero ahora el grupo liderado por Jongyoon Han, del Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Centre ha desarrollado un método para analizar una muestra tan pequeña como 10 microlitros de sangre, para el que no se necesita ningún técnico superentrenado y que no necesita un equipamiento excesivamente caro. En el año 2010 Ralph Weissleder y Hakho Lee consiguieron fabricar un equipo NMR mucho más pequeño y barato y basándose en su experiencia el gruo de Han han conseguido diseñar un equipo en miniatura de Relaxometría de Resonancia Magnética (MRR por sus siglas en inglés). La MRR es un tipo de NMR (sí, parece un trabalenguas). Adicionalmente, la técnica de detección desarrollada permite detectar a la hemozoína en muestras de sangre sin necesidad de procesarlas y a unos niveles de hasta 10 trofozoítos por microlitro, mucho antes de que el paciente empiece a mostrar algún síntoma por lo que se puede empezar a tratar de manera temprana. Eso es muy importante si tenemos en cuenta que los países afectados por la malaria suelen ser países en vías de desarrollo con recursos y personal muy limitados.

Sistema portátil de Relaxometría por Resonancia Magnética desarrollado por Weng Kung Peng, Lan Chen y Jongyoon Han. Pesa unos 250 gramos y sus dimensiones son de 16 x 9 cm. El campo magnético de 0,76 Teslas es generado por unos imanes del tamaño de una moneda. Origen de la imagen: MIT


¿Cuáles son los "peros"? en primer lugar todavía es una técnica experimental. Se ha probado con muestras de ratón y con el parásito cultivado en condiciones de laboratorio. Se tiene que realizar un test en condiciones reales con un gran número de muestras clínicas. Quizás factores como la genética o la dieta del paciente podrían afectar al resultado. También está descrito que hay casos clínicos en los que los niveles de hemozoína no son muy elevados por lo que quizás la enfermedad no sería detectada. De todas formas, está claro que es un avance significativo.

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Butykai, A., Orbán, A., Kocsis, V., Szaller, D., Bordács, S., Tátrai-Szekeres, E., Kiss, L., Bóta, A., Vértessy, B., Zelles, T., & Kézsmárki, I. (2013). Malaria pigment crystals as magnetic micro-rotors: key for high-sensitivity diagnosis Scientific Reports, 3 DOI: 10.1038/srep01431

Skinner, N. (2014). Quick test for malaria shows promise Nature DOI: 10.1038/nature.2014.15796

Peng, W., Kong, T., Ng, C., Chen, L., Huang, Y., Bhagat, A., Nguyen, N., Preiser, P., & Han, J. (2014). Micromagnetic resonance relaxometry for rapid label-free malaria diagnosis Nature Medicine, 20 (9), 1069-1073 DOI: 10.1038/nm.3622

domingo, 29 de junio de 2014

Aspergilomarasmina A: una vieja conocida, una nueva amiga.



En 1965 unos investigadores franceses describieron una molécula asociada a la marchitez de las hojas producida por un hongo de la especie Aspergillus flavus. Bautizaron a esa fitotoxina como Aspergilosmarasmina A (AMA para abreviar). En los años 80 se estudió su potencial como sustancia inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina y en los 90 como una molécula capaz de inhibir la activación enzimática de la endotelina, sin embargo en ambos casos no se llegó a a la fase final de producirla como medicamento.

La aspergilosmarasmina A actuaba como inhibidor de las enzimas que debían de procesar a la angiotensina y a la endotelina. Ambas enzimas son de la familia de las metaloproteasas, la misma familia a la que pertenecen las metalobetalactamasas como NDM-1. Así que alguien pensó que si la aspergillomarasmina inhibía a unas, bien podía inhibir a las otras. Y si eso era así, quizás podría utilizarse como un adyuvante para tratar infecciones provocadas por bacterias resistentes a los antibióticos betalactámicos (de manera semejante a lo que se hace con el ácido clavulánico y la ampicilina).

(a) Estructura de la Aspergillomarasmina A (AMA) (b) Actividad inhibitoria de la AMA sobre las betametalolactamasas NDM-1 (cuadrados negros) y VIM-2 (círculos blancos). Los cuadrados negros indican que la actividad de la serin-carbapenemasa OXA-48 no se ve afectada por AMA (fuente:  King et al. Nature)


Y eso es precisamente lo que han hecho en el grupo de investigadores canadienses liderado por Gerard D. Wright y que ha sido publicado recientemente en la revista Nature. Han comprobado que la AMA inhibe de manera irreversible a las betalactamasas NDM-1 y VIM-2, pero no es activa frente a otras carbapenemasas. A continuación, lo que hicieron fue comprobar si esta molécula podía darse en combinación con un antibiótico. La AMA es muy efectiva contra las metalobetalactamasas, pero no es un antibiótico por lo que no mata a las bacterias. Lo que se hizo fue combinar el antibiótico meropenem con AMA y comprobar si el cóctel era efectivo frente a diferentes cepas bacterianas conocidas por ser portadoras de resistencias a los antibióticos betalactámicos.

Diversos patógenos Gram negativos portando resistencias a los betalactámicos fueron enfrentados a una combinación de meropenem y AMA. Todos aquellos que portaban las resitencias NDM y VIM fueron sensibles (barras rojas y azules). Los que portaban las resistencias AIM, IMP y SPM-1 no. (Fuente: King et al. Nature)


Pero una cosa es que en un ensayo in vitro esa combinación funcione y otra muy distinta es que pueda ser usada como una posible terapia frente a una infección. Y por eso el siguiente paso fue utilizar un modelo animal. En primer lugar los investigadores utilizaron ratones a los que se les inyectó intraperitonealmente una dosis subletal de la cepa N11-2218 de Klebsiella pneumoniae. Esta cepa es resistente al antibiótico meropenem. Luego dividieron a los ratones en tres grupos: el grupo control al que sólo se le inyectó suero salino, un segundo grupo con ratones que sólo serían tratados con meropenem, y finalmente otro con ratones a los que se les administraría meropenem más AMA. Posteriormente analizaron la cantidad de bacterias presentes en bazo (spleen) y en hígado (liver). Se observó una reducción de diez veces en el número de bacterias presentes en ambos órganos. Pero todavía faltaba por ver si el antibiótico era efectivo frente a una infección grave. Así que en el siguiente experimento utilizaron ratones a los que se les inyecto una dosis letal de K. pneumoniae. En este caso los ratones fueron divididos en cuatro grupos: control con suero salino, tratados sólo con una inyección de meropenem, tratados sólo con una inyección de AMA y tratados con una inyección de la combinación de meropenem más AMA. En este último grupo, todos los ratones sobrevivieron menos uno (95% de supervivencia).

Efecto de la combinación antibiótico meropenem más AMA en el tratamiento de infecciones experimentales en ratones. En las gráficas de arriba se muestra el nivel de bacterias en bazo y en hígado. En la parte de abajo se muestra el porcentaje de supervivencia (ver el texto para más detalles. Fuente King et al. Nature


¿Qué es lo que va a pasar ahora? Los resultados son muy prometedores porque permiten vislumbrar una forma de alargar la efectividad de diversos antibióticos frente a las cada vez más frecuentes resistencias bacterianas. El estudio de la AMA puede servir como base para desarrollar nuevas moléculas que inhiban a las enzimas responsables de inactivar a los antibióticos. Pero hay un largo camino que recorrer hasta que la AMA llegue a las farmacias, si es que llega. Primero hay que determinar si los niveles en los que la AMA puede ser usada en combinación con los antibióticos no afectan a la función de las enzimas que regulan la angiotensina y la endotelina lo que podría provocar cambios indeseables en la presión sanguínea de los pacientes. Y seguidamente hay que empezar a diseñar los ensayos clínicos para probar que efectivamente esta estrategia es efectiva en humanos. Pero está claro que el redescubrimiento de la aspergilomarasmina A es una buena noticia.




Esta entrada participa en el XXXVI Carnaval de la Química (Edición Kr) alojado en Café de Ciencia y en el XXXI Carnaval de la Biología alojado en Retales de Ciencia

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King, A., Reid-Yu, S., Wang, W., King, D., De Pascale, G., Strynadka, N., Walsh, T., Coombes, B., & Wright, G. (2014). Aspergillomarasmine A overcomes metallo-β-lactamase antibiotic resistance Nature, 510 (7506), 503-506 DOI: 10.1038/nature13445

lunes, 19 de mayo de 2014

Polizones del espacio

El selfie de la Curiosity. (Nature)


Parece que la panespermia puede ser cierta, pero en sentido contrario. Según podemos leer en la revista Nature la sonda Curiosity podría haber llevado consigo unos cuantos polizones microbianos terrícolas que ahora estarían en Marte.

Las sondas espaciales son esterilizadas antes de ser enviadas a explorar otros planetas. Hasta ahora se pensaba que los procedimientos empleados eran suficientes para asegurar que ningún microorganismo terrícola pudiera viajar de polizón en una sonda. También se pensaba que cualquier microorganismo que escapara esos procedimientos probablemente no sobreviviría al largo viaje interplanetario y al intenso calor de la entrada en la atmósfera del planeta a explorar. Pero un trabajo presentado en el último congreso de la ASM parece indicar que quizás no sea así. Los microbios son mucho más duros de lo que se pensaba.

Los investigadores tomaron muestras de las diferentes superficies de la Curiosity incluyendo el escudo térmico y el sistema de vuelo antes de su lanzamiento hacia el Planeta Rojo. Encontraron 377 cepas pertenecientes a 65 especies bacterianas. Un 11% de ellas eran capaces de aguantar condiciones de alta radiación UV, frío y sequedad extrema, pHs muy ácidos o muy básicos. Muchas de ellas pertenecían al género Bacillus, conocido por su capacidad de producir endosporas altamente resistentes. Pero también han encontrado otros microorganismos capaces de aguantar esas condiciones extremas sin necesidad de estructuras de protección, sino que lo hacen mediante cambios en su metabolismo.

¿Habrá llegado a Marte? Bacillus subtilis con una endospora (Science Photo Library)


Según la microbióloga Stephanie Smith, líder del grupo investigador, todavía no saben con seguridad si realmente se ha producido dicha contaminación, pero en su opinión la NASA debería extremar las precauciones en sus procedimientos de esterilización. En el año 2011 se informó de que uno de los aparatos que portaba la sonda no había sido esterilizado convenientemente. Sobre todo con vistas a la misión que se quiere lanzar en el año 2020 y en la que la sonda a emplear sería capaz de enviar a la Tierra unas muestras de suelo marciano. No haría mucha gracia encontrar que dichas muestras se hubieran contaminado con microorganismos polizones terrícolas.

Esta entrada participa en la edición XXX carnaval de la Biología alojada en Activa tu neurona y en el LII carnaval de la Física que aloja el blog La Enciclopedia Galáctica.

lunes, 12 de mayo de 2014

La revolución CRISPR/Cas



Ni CRISPR es el nombre de una nueva marca de aperitivo crujiente ni Cas es el nombre de un refresco para acompañarlo. La primera palabreja es el acrónimo de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que en español significa "Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas". La segunda es el nombre de una serie de proteínas, principalmente unas nucleasas, que las llamaron así por CRISPR associated genes (es decir: "genes asociados a CRISPR". No se rompieron la cabeza). Dicho así tampoco es que se aclaren mucho las cosas ¿no? Y sin embargo es posible que estemos contemplando el desarrollo de una tecnología genética que va a suponer una auténtica revolución comparable a la que supuso la famosa PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para las Ciencias Biológicas.

Vamos intentar describir lo que es CRISPR/Cas en una sola frase: es el sistema inmune de las bacterias. ¡Espere! No deje de leer todavía. No es tan descabellado como parece. En los vertebrados, incluidos los seres humanos, el sistema inmune es el conjunto de células y órganos encargados de defender al organismo de las infecciones provocadas por bacterias o virus. No es exclusivo de los vertebrados, ya que otro tipo de animales como los insectos, crustáceos, moluscos, incluso esponjas, también tienen un sistema inmune, aunque mucho más simple. Pero las bacterias son seres unicelulares, entonces ¿cómo puede tener una bacteria un "sistema inmune"?

Las bacterias también pueden ser infectadas, por ejemplo por virus. Ya hemos comentado en otros artículos anteriores que un virus es un pirata de la célula. Los virus que infectan bacterias son llamados bacteriófagos, o simplemente fagos. Los más simples están compuestos de un ácido nucleico que puede ser ADN o ARN como material genético, y de una envoltura proteica denominada cápside. De manera muy simple el ciclo biológico de un fago es el siguiente: el virus se une a la bacteria gracias a su cápside y le inyecta su ácido nucleico. Una vez dentro el ácido nucleico viral toma el control de las funciones celulares, sobre todo del proceso de biosíntesis de proteínas. A partir de ese momento, la bacteria sólo replica el material genético viral y sintetiza proteínas virales. Según se van acumulando en el interior de la célula se van ensamblando los nuevos virus, hasta que al final la bacteria revienta (se lisa) y los nuevos virus son liberados.

Ciclo lítico de un fago. Origen de la imagen: Biología Médica


Está claro que a una bacteria le interesaría tener alguna forma de neutralizar a un virus que se mete en su interior (o cualquier otro ADN extraño, como el de un plásmido). Una forma de hacerlo es tener unas enzimas que sean capaces de distinguir entre el material genético de la bacteria y entre el material genético vírico, y una vez hecha la distinción, destruir al material genético del virus. Esas enzimas se descubrieron en la segunda mitad del siglo XX y se le conoce como el sistema de restricción/modificación: las que destruyen el ADN foráneo se las denomina enzimas de restricción, y las que reconocen y modifican el ADN propio para que no sea destruido se las llama enzimas de modificación. Las primeras sobre todo son una de las herramientas más importantes dentro de la ingeniería genética. Pero hay otra forma de neutralizar a un virus que infecta a una bacteria: el sistema CRISPR/Cas.

La historia tuvo su origen cuando se comenzó a mapear los genomas completos de bacterias y otros microorganismos. Se esperaba que unos seres vivos tan pequeños tuvieran su información genética muy compactada en el ADN. Y en general es así. Pero también había sorpresas. Una zona del genoma de muchos microorganismos, sobre todo arqueas, estaba llena de unas secuencias que parecían repeticiones palindrómicas sin ninguna función aparente. Estas repeticiones estaban separadas entre si mediante unas secuencias denominadas "espaciadores" que se asemejaban a secuencias encontradas en virus y en plásmidos. Justo delante de esas repeticiones y "espaciadores" hay una secuencia que se la denomina "líder". Muy cerca de este agrupamiento se podían encontrar unos genes que codificaban para un tipo de nucleasas: los genes cas.


Estructura del locus CRISPR(A) Las secuencias repetidas de unos 32 pares de bases (gris oscuro) están intercaladas por las secuencias "espaciadoras" (colorines). El número de estas secuencias puede variar enormemente entre diferentes cepas bacterianas de la misma especie.(B) La secuencia conservda "líder" (en gris claro) de unos cuantos cientos de pares de bases está delante del agrupamiento de repeticiones y espaciadores (C) Los genes cas están cercanos al locus CRISPR. Se muestran la estructura de dicho locus en tres especies bacterianas como ejemplo. Fuente de la imagen: Karginov FV y Hannon GJ. Mol Cell 2010


Vamos a intentar explicar esta situación con una analogía. Supongamos que el genoma de la bacteria es como un libro de instrucciones. Imaginemos que ese libro se titula "Haga una Escherichia coli en 1000 fáciles lecciones". Las secuencias CRISPR sería como encontrar 50 páginas en las que sólo leyéramos decenas de frases palindrómicas como estas: "Daba la zorra arroz al abad", "¿Acaso hubo búhos acá?", "La ruta nos aportó otro paso natural", y esas frases separadas entre sí por una serie de textos que parecerían sacados de otros libros titulados "Cómo hacer un fago" o "Cómo hacer un plásmido". A primera vista pensaríamos que esas páginas contienen información sin sentido y que se trata de un error de imprenta. Pero si encontráramos que todos los ejemplares de otros libros dedicados a Streptococcus pyogenes o Pyrococcus furiosus contienen ese mismo tipo de páginas, entonces empezaríamos a pensar que deberían servir para algo.

Volvamos a los virus. Como hemos dicho antes esos seres son piratas de la célula. Siguiendo con la analogía del libro, un virus sería como una página suelta que si es capaz de integrarse en un libro, entonces se fotocopia de manera que acaba ocupando todas las páginas de ese libro. Es como si pusiéramos dentro de un ejemplar de "El Quijote" una página de las memorias de Belén Esteban y al final en lugar de la obra de Cervantes acabamos con un tocho de hojas de la teletertuliana. Pues bien, si esa página-virus se integra en un libro que contiene las páginas de palíndromos lo que observaríamos es que esa página-virus no se fotocopia, sino que es destruida. Son precisamente esas páginas que no parecen tener sentido las encargadas de dicha protección.

De manera muy simplificada, a nivel molecular lo que está ocurriendo es lo siguiente. Cuando el material genético del virus entra dentro de la bacteria debe de tomar el control de la maquinaria celular y para ello empieza a interaccionar con diversos componentes celulares. Pero puede darse el caso que interaccione con un complejo formado por una proteína Cas unida al ARN producido a partir de las secuencias CRISPR. Si ocurre eso, resulta que el material genético viral es inactivado y posteriormente degradado. Pero el asunto no se queda ahí. Las proteínas Cas hacen otra cosa además de destruir el material genético del virus. Resulta que son capaces de tomar una pequeña parte del ADN viral, modificarlo e integrarlo dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esa forma, si esa bacteria o su descendencia se encuentra con ese mismo virus, ahora inactivará de forma mucho más eficiente al material genético viral.


Funcionamiento del sistema CRISPR/Cas. Un virus ha introducido su ADN en la bacteria. A ese ADN se le ha unido un complejo que consiste en un tipo de proteína Cas (verde) que lleva unido un pequeño crARN ("cr" por CRISPR). Esa unión inactiva al ADN viral y así puede ser degradado. El pequeño crARN proviene del procesamiento de un crARN de mayor tamaño por parte de otro tipo de proteína Cas (azul). Ese ARN es el producto de la transcripción de todas las secuencias CRISPR presentes en el genoma de la bacteria. En paralelo a la inactivación del ADN viral, otro tipo de proteínas Cas (rojo) reconocen al ADN viral y a partir de él crean un pequeño segmento que integraran en las secuencias CRISPR, de esa forma la bacteria formará complejos crARN/Cas mucho más eficientes en su unión al ADN viral en caso de una nueva infección por el mismo virus. Imagen realizada a parir de material de la Wikipedia y del artículo Karginov FV y Hannon GJ. Mol Cell 2010 .


Recapitulemos. El llamado "sistema inmune de las bacterias" es simplemente un mecanismo por el cual se reconoce genoma viral, se inactiva y se destruye, al mismo tiempo que una parte de ese genoma viral se incorpora al genoma de la bacteria para así generar una protección más eficiente. Esto es el típico resultado de lo que llamamos Ciencia Básica. La humanidad ha adquirido un nuevo avance en el conocimiento sobre cómo funciona el mundo. ¡Bravo! ¡Estupendo! Pero, y esto, ¿para qué sirve?

Esa es la típica pregunta que se hace cualquier miembro de la sociedad. Y como científicos no debemos olvidar que lo que hacemos suele estar pagado con los impuestos del sufrido ciudadano, así que hay que rendirles cuentas y demostrarles que el conocimiento en ciencia básica puede que no tenga una aplicación útil inmediata, pero que la puede tener en el futuro, y ser tan importante que cambie por completo sus vidas y la de sus hijos. Eso es lo que sucedió antes con la internet, con el horno microondas y con los test para detectar enfermedades genéticas. Y también está pasando con el sistema CRISPR/Cas.

Como hemos visto antes, una de las cosas que hace el sistema CRISPR/Cas es introducir ADN de un organismo, el virus, en el ADN de otro organismo, la bacteria. Y lo hace con una precisión absoluta. Es el mejor sistema que conocemos para realizar esa integración. En relación con los sistemas anteriores que se utilizaban en ingeniería genética sería como comparar un serrucho con una sierra eléctrica. No es de extrañar que la revista Nature le dedicara una portada a la proteína Cas9 (puede verse arriba) ¿Y este sistema no podría usarse con otros organismos? Pues la respuesta es sí. El sistema CRISPR/Cas puede ser utilizado para introducir cualquier tipo de ADN en el ADN de cualquier tipo de ser vivo, sean estos bacterias, setas, plantas, insectos, peces, ratones, monos e incluso seres humanos (esto último aún no se ha hecho). Es decir, el sistema CRISPR/cas va camino de convertirse en una herramienta que nos va a permitir por ejemplo hacer terapia génica con gran precisión y así tratar enfermedades como la hemofilia o la enfermedad de Huntington.


Funcionamiento de la enzima Cas9. Esta nucleasa tien dos sitios activos que pueden romper cada una de las cadenas de una doble hélice de ADN. La enzima es guiada a una secuencia concreta de ADN que queremos cortar gracias a unas secuencias denominadas PAM (por las siglas en inglés de motivos adyacentes a los protoespaciadores) y que pueden ser sintetizadas a medida en el laboratorio. La molécula de ADN puede ser vuelta a ligar gracias a los sistemas de reparación. Pero si hay presente un ADN dondador homólogo a la secuencia que ha sido cortada entonces puede introducirse por recombinación homóloga y de esa forma realizar un inserción genética dirigida tanto en bacterias, líneas célulares de mamíferos, o embriones de pez zebra. Origen de la imagen: Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Doudna. Nature 2013.


Y los primero pasos ya se han dado. El Instituto Technológico de Massachuset anunció el pasado 30 de marzo que había conseguido curar a un ratón adulto de una enfermedad hepática de carácter genético utilizando el sistema CRISPR/Cas. Los ratones estaban afectados de tirosinemia de tipo I, una enfermedad en el que el gen que codifica la que la enzima fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH) no funciona por una mutación. Esta enzima se encuentra en los hepatocitos, las células del hígado, y si no funciona entonces el aminoácido tirosina no se degrada correctamente por lo que se acumula fumarilacetoacetato, lo que acaba causando fallos en el hígado y en los riñones. Esta enfermedad también se da en humanos, su incidencia es de 1 entre 100.000 nacimientos y puede provocar retraso mental, problemas hepáticos graves e incluso la muerte. Hay un tratamiento paliativo a base de una dieta baja en proteínas y administrando nitisinona. Otra posibilidad es realizar un trasplante hepático.

Lo que hicieron los investigadores fue inyectar en una vena de los ratones a la proteína Cas-9 con un segmento de ARN unido a otro pequeño segmento de ADN. La función del segmento de ARN es indicar a la proteína Cas-9 dónde tenía que cortar en el gen FAH dentro del genoma de las células de ratón. La función del segmento de ADN era integrarse en ese gen y sustituir la mutación deletérea por la secuencia correcta del gen FAH. La inserción y sustitución sólo funcionó en 1 de cada 250 hepatocitos, pero esas células ya eran normales y sanas. Y mientras las portadoras de la mutación se morían por el acúmulo de fumarilacetoacetato, las sanas las iban remplazando. En 30 días un tercio de todas las células de los hígados de los ratones tratados eran células curadas y los roedores podían sobrevivir sin tratamiento.

Los ratones Fahmut/mut portan una mutación homocigótica en la que una Guanina ha sido sustituida por una Adenina en el último nucleótido del exon 8. Esta mutación causa que el exon 8 sea removido durante el procesamiento del mRNA del gen Fah lo que da lugar a una proteína totalmente inactiva (representado por los segmentos debajo de la secuencia). Lo que se hace es inyectar proteína Cas9 junto con un crARN diseñado para ser dirigido al lugar donde está la mutación y un ADN de cadena sencilla (ssDNA) que porta la secuencia correcta. En las microfotografías de la parte inferior puede verse una tinción de hematoxilina-eosina (H&E) de secciones del hígado provenientes de ratones tratados después de 30 días. Al la izquierda se ve la de un ratón sin la mutación (Fah+/+, un ratón Fahmut/mut al que se le ha inyectado ssDNa y Cas9 sin el crARN-guía y el , y un ratón Fahmut/mut al que se le ha inyectado ssDNA y Cas9 con el crARN-guía. En las microfotografías superiores la barra representa 100 μm y en las inferiores 20 μm . Nótese la aparición de células sanas que aparecen en el ratón tratado con Cas9 guiado. Fuente de la imagen: Yin et al. Nature Biotechnology 2014.

Este es sólo un ejemplo de los muchos trabajos que se están realizando con este sistema. Según la revista Nature Biotechnology, en el último año y medio se han publicado más de 125 artículos científicos y se han fundado tres compañías biotecnológicas dedicadas a comercializar y mejorar este sistema. El último mes, las Universidades de California de San Francisco (UCSF) y de Berkeley (UCB), y la Fundación Li Ka Shing habían invertido 12 millones de dólares en la creación de la Iniciativa de Innovación Genómica (IGI) dedicada a acelerar la adopción de esta tecnología. No está mal como aplicación de un descubrimiento de Ciencia Básica realizado en bacterias en el año 1987.

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Karginov, F., & Hannon, G. (2010). The CRISPR System: Small RNA-Guided Defense in Bacteria and Archaea Molecular Cell, 37 (1), 7-19 DOI: 10.1016/j.molcel.2009.12.033

Shen, H. (2013). CRISPR technology leaps from lab to industry Nature DOI: 10.1038/nature.2013.14299

Charpentier, E., & Doudna, J. (2013). Biotechnology: Rewriting a genome Nature, 495 (7439), 50-51 DOI: 10.1038/495050a

Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R., Benedetti, E., Grompe, M., Koteliansky, V., Sharp, P., Jacks, T., & Anderson, D. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype Nature Biotechnology DOI: 10.1038/nbt.2884

viernes, 2 de mayo de 2014

Paleovirología de la viruela

El antropólogo forense Scott Warnasch examina el cadáver accidentalmente desenterrado en Queens, New York. Se puede ver los restos del ataúd de metal. Todavía no sabían que esa persona había muerto de viruela. Origen de la imagen:  Sara Reardon, Nature 2014


Hace tres años comenté en este blog el hallazgo de unos restos de costra de una pústula de viruela-vacuna encontrados en una carta del año 1876. El CDC de Atlanta fue avisado y analizó dichos restos para asegurarse de que no hubiera ningún tipo de virus activo. Hubo gente que pensó que quizás eso fue un poco exagerado, pero si tenemos en cuenta la reciente noticia de que se ha "revivido" a un virus del permafrost de hace 30.000 años entonces uno empieza a pensar que quizás la acción del CDC no fue tan exagerada. Y si ya se lee el reciente artículo aparecido en Nature entonces le parecerá totalmente adecuada.

En el año 2011 se estaban poniendo los cimientos para una construcción en el barrio neoyorquino de Queens cuando los obreros realizaron un macabro descubrimiento: un ataúd de hierro con unos restos humanos en su interior. Inicialmente se pensó en que era la víctima de un crimen, pero posteriormente se estableció que en realidad debería ser alguien que fue enterrado en el cementerio de una parroquia cercana hacia mediados del siglo XIX. Se trataba de una mujer negra que vestía camisón y calcetines. Pero lo que más llamó la atención a los investigadores era que había sido enterrada en un ataúd de hierro, un auténtico lujo para la época que le tocó vivir. Ese ataúd había permitido que los restos se conservaran en bastante buen estado.

Detalle de la piel del cadáver de la mujer desenterrada en Queens. Se pueden observar los restos de las pústulas en su frente. Origen de la imagen: McCollum et al. Emerging Infectious Diseases 2014.


Al examinar el cuerpo los forenses observaron que había una serie de lesiones y de granos diseminados por todo el cuerpo. Esas lesiones y granos recordaron a Bradley Adams, el jefe de antropología forense de Nueva York, las pústulas que había visto en fotos de enfermos de viruela. Los forenses se dieron cuenta que el ataúd de hierro no era un lujo, en realidad era un contenedor para evitar que la infección se diseminara. Inmediatamente la zona de obras fue clausurada y se llamó al CDC de Atlanta para que clausurara e investigara los restos. La epidemióloga Andrea McCollum y su equipo fueron enviados a Queens y aunque suponían que era muy poco probable que hubiera algún virus activo en dichos restos se tomaron muestras para analizarlas. Los análisis confirmaron que había DNA del virus, pero estaba tan degradado que no había partículas virales activas.

Momia de Ramses V. Se supone que los granos que se observan en su rostro son restos de las pústulas de viruela. Origen de la imagen:  Sara Reardon, Nature 2014


Lo cierto es que no sería la primera vez que se han encontrado restos humanos con viruela. El cadáver más famoso en el que pueden apreciarse presencia de pústulas corresponde a la momia del faraón Ramses V, enterrado hace 3200 años. Cuando se tomaron muestras de la piel y se analizaron usando técnicas inmunológicas se encontró una pequeña reacción con anticuerpos frente a la viruela. Se piensa que es posible que el virus podría estar preservado si los restos se mantienen a baja temperatura. Durante la campaña de erradicación de la viruela se observó que el virus era muy estable si permanecía en el tejido humano. Cuando una pústula revienta, la sangre se coagula en el lugar y las proteínas fibrosas del coagulo forman un denso entramado atrapando al virus. Esas costras envejecidas eran las que se utilizaban para realizar la variolación, el precedente de la vacunación. En 1968, un grupo holandés publicó sus resultados sobre la supervivencia del virus de la viruela en costras recolectadas desde 1950 y guardadas en sobres. Comprobaron que el virus seguía activo a los 13 años, cuando se les terminaron las costras. El experimento demostró que el virus de la viruela podía sobrevivir por más de una década en un clima templado.

¿Y en un clima frío? En el año 2004 un equipo de antropólogos estaba explorando la región siberiana de Yakutia. Encontraron una tumba con cinco cuerpos momificados y congelados dentro de un ataúd de madera. Los cuerpos parecían pertenecer todos a la misma familia y todo indicaba a que murieron súbitamente a comienzos del siglo XVIII. En el mejor preservado de todos ellos encontraron restos de DNA del virus y aunque estaba muy degradado la secuencia que se obtuvo mostró que era una cepa distinta a la que circuló en Asia y Europa durante el siglo XX.

Momias siberianas de la región de Yakutia enterradas en un ataúd de madera y de las que se pudo extraer DNA del virus de la viruela suficiente para realizar un análisis filogenético. En el dendrograma puede verse que el DNA de Siberia (PoxSib) es bastante distinto del obtenido de diversas cepas del siglo XX (se indica el lugar y el año de aislamiento, por ejemplo Tanz65 es Tanzania 1965). Origen de la imagen: Biagini et al. NEJM 2012.


Supongo que en la próxima asamblea que va a celebrar la OMS para discutir si se destruyen los stocks de viruela que se mantienen en los congeladores del CDC de Atlanta y de los laboratorios VECTOR en Rusia continuarán con su decisión de seguir manteniéndolos. Lo cierto es que hay un cierto temor a que en alguna ocasión se pueda desenterrar a este virus, pero más miedo existe a que alguien mantenga en secreto algún stock del virus o que alguien intente aprovechar la secuencia genética del virus, publicada en 1990, para reconstruirlo. Y esos stocks son los únicos que hay disponibles para poder realizar nuevas vacunas o probar nuevos antivirales.


Esta entrada participa en la XXX edición del Carnaval de la Biología alojado en el blog Activa tu neurona

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Wolff HL, & Croon JJ (1968). The survival of smallpox virus (variola minor) in natural circumstances. Bulletin of the World Health Organization, 38 (3), 492-3 PMID: 4299528

Biagini, P., Thèves, C., Balaresque, P., Géraut, A., Cannet, C., Keyser, C., Nikolaeva, D., Gérard, P., Duchesne, S., Orlando, L., Willerslev, E., Alekseev, A., de Micco, P., Ludes, B., & Crubézy, E. (2012). Variola Virus in a 300-Year-Old Siberian Mummy New England Journal of Medicine, 367 (21), 2057-2059 DOI: 10.1056/NEJMc1208124

McCollum, A., Li, Y., Wilkins, K., Davidson, W., Paddock, C., Karem, K., Reynolds, M., & Damon, I. (2012). Poxvirus viability and signatures in historical relics International Journal of Infectious Diseases, 16 DOI: 10.1016/j.ijid.2012.05.224

Reardon, S. (2014). Infectious diseases: Smallpox watch Nature, 509 (7498), 22-24 DOI: 10.1038/509022a

viernes, 24 de enero de 2014

De cómo un perro se transformó en un parásito para hacerse inmortal



Hace unos días, @Raven_neo lanzó la siguiente pregunta en Twitter:



Se inició un interesante debate. En mi intervención yo escribí lo que sigue:



Pues bien, después de leer este artículo de Carl Zimmer me temo que voy a tener que replantearme mi respuesta (*). La historia me ha hecho recordar la secuencia de la película "La cosa" (John Carpenter, 1981) con la que ilustro el comienzo de este comentario. Hace 200 años un veterinario llamado Delabere Pritchett Blaine describió en su libro A Domestic Treatise on the Diseases of Horses and Dogs un tipo de cáncer que aparecía en los órganos sexuales caninos y que producía "úlceras acompañadas de excrecencias similares a un hongo" (an ulcerous state, accompanied with a fungous excrescence). Los tumores recordaban a pequeños brotes de coliflor y tendían a sangrar. Algunos perros morían debido al tumor. Pero en otros el tumor remitía y desaparecía. En 1871 el veterinario ruso M.A. Novinsky demostró que dicho tumor era infeccioso. Corto un trozo y lo frotó en los genitales de un perro sano. Al poco tiempo se había desarrollado un tumor. De esa forma pudo determinarse que la forma de transmisión era por contacto sexual, y por eso se le conoce por Tumor Venéreo Transmisible Canino (o CTVT por sus siglas en inglés). Este tipo de tumor está presente en los cinco continentes.

Tumores infecciosos. A la izquierda el Tumor Facial del Demonio de Tasmania (fuente Wikipedia) A la dereecha, los dos casos de Tumor Venéreo Transmisible Canino estudiados en el artículo que se resume en esta entrada (Fuente: Murchinson et al. Science)


Lo primero que se pensó es que debía ser algún tipo de virus oncogénico el causante último de los tumores. Las células tumorales del donante vivirían lo suficiente en el receptor como para infectar los tejidos. Pero al comenzar a analizar el ADN de los tumores comenzaron a aparecer las sorpresas. En el año 2006 se demostró que el agente etiológico del tumor eran las células cancerosas. No había ningún virus o similar. Ahora, un nuevo estudio aparecido en la revista Science ha aclarado mucho más las cosas.

El equipo de la Universidad de Cambridge ha secuenciado el genoma completo de dos líneas de CTVT: una provenía de un perro australiano y el otro de un cocker spaniel brasileño. Cuando compararon ambos genomas se encontraron que ambas líneas eran muy similares y presentaban en común dos millones de mutaciones que no estaban presentes en el genoma de una célula normal de perro. Ese resultado lo que indicaba es que ambas líneas tumorales tienen un ancestro común. Además, esas mutaciones permitieron a Elizabeth Murchison y sus colaboradores establecer un reloj molecular para poder estimar cuando apareció dicho tumor. Cuando una célula tumoral se multiplica su DNA muta con una frecuencia bastante regular, así que los dos millones de mutaciones parecen indicar que el tumor se inició hace 11.000 años, justo al final de la Edad de Hielo.

Imágenes del cariotipo de un perro normal (foto de la izquierda), de una línea tumoral de un perro de Cabo Verde (foto central) y de la línea tumoral de un perro italiano (foto derecha). Nótese el gran parecido entre ambas líneas tumorales. (Fuente: Murchinson et al. Science)


¿Y qué tipo de perro había en la Edad de Hielo? pues por el genoma de las células tumorales todo indica a que era un huskie o un malamut de Alaska, uno de los linajes más antiguos de perros domésticos. Los investigadores especulan con que hace 11.000 años una célula inmune de un perro (o una perra, eso no se sabe aún) se transformó en cancerosa y creció en los genitales del animal acumulando unos cuantos cientos de miles de mutaciones. Cuando el perro se apareó, el tumor sangró y algunas de las células acabaron en los genitales de su compañera. Lo normal es que las células del sistema inmune del perro infectado hubieran destruido a las tumorales al considerarlas "extrañas". Pero eso no ocurrió. Se piensa que fue debido a que el grupo de perros era muy pequeño y seguramente todos los miembros debían de estar emparentados. Por ello el sistema inmune no las reconoció como "extrañas" y esas células acabaron creciendo en su nuevo hospedador. Poco a poco el tumor se fue extendiendo a los otros perros. Pero el tumor no dejó de evolucionar y mutar, volviéndose cada vez más eficiente en su nueva función de parásito. Por ejemplo esquivando el sistema inmune de perros de otras razas o robando las mitocondrias de los tejidos que infecta. También se piensa que quizás se volvió menos virulento para así permitir una mejor transmisión al aumentar la vida media del portador.

Análisis genómico que muestra donde se sitúa el fundador del CTVT dentro de las diversas razas caninas. Fuente de la imagen: Heidi G. Parker y Elaine A. Ostrander. Science.


Las mutaciones también han servido al equipo de Murchinson para saber cuando vivió el ancestro común de las dos líneas de CTVT analizadas. En este caso lo único que tenían que hacer era mirar cuáles eran las mutaciones exclusivas de cada tumor. Y así han llegado a la conclusión de que el antepasado vivió hace 460 años, en pleno siglo XVI. Una época en que precisamente se realizaron los grandes viajes de exploración y colonización alrededor del mundo.

Este no el único caso de tumor infeccioso. En 1980 apareció el llamado Tumor Facial del Demonio de Tasmania. Es un tipo de tumor que se transmite entre esos marsupiales cuando pelean entre sí. Al igual que el CTVT, apareció en un grupo pequeño y muy consanguineo. Pero una vez establecido se ha ido transmitiendo a un mayor número de animales. Lo malo es que el tumor facial es un muy agresivo y el animal muere en poco tiempo. Es tan agresivo que se teme que puede acabar con toda la especie del demonio de Tasmania en un par de generaciones, a menos que ocurra algo similar al CTVT y se vuelva menos virulento.

(*)Ya me la he replanteado y no la cambio. Un tumor no es un perro y en el improbable caso que al CTVT se le reconozca el estatus de especie, entonces estaríamos en la situación de partida (dos especies distintas).


Esta entrada participa en el XXVIII carnaval de la Biología alojado en el blog "Vida y Estrellas"


ResearchBlogging.org

Parker HG, & Ostrander EA (2014). Cancer. Hiding in plain view--an ancient dog in the modern world. Science (New York, N.Y.), 343 (6169), 376-8 PMID: 24458629

Murchison EP, Wedge DC, Alexandrov LB, Fu B, Martincorena I, Ning Z, Tubio JM, Werner EI, Allen J, De Nardi AB, Donelan EM, Marino G, Fassati A, Campbell PJ, Yang F, Burt A, Weiss RA, & Stratton MR (2014). Transmissable dog cancer genome reveals the origin and history of an ancient cell lineage. Science (New York, N.Y.), 343 (6169), 437-40 PMID: 24458646

lunes, 30 de diciembre de 2013

Dos mejor que tres: un poda en el árbol de la vida

Xmas Darwin Phylogenetic Tree (origen de la imagen)




Hoy se cumple el primer aniversario de la muerte de Carl Woese, uno de los científicos de los que puede decirse eso de que "sus descubrimientos cambiaron los libros de texto". Bueno, ahora parece que algo parecido está sucediendo con su más famosa hipótesis, y probablemente dentro de poco habrá que volver a cambiar los libros de texto.

Ya hemos comentado en este blog que en 1977 Woese y Fox presentaron su árbol filogenético de tres ramas. El árbol fue construido al comparar la secuencia del ARN ribosómico, una macromolécula presente en todos los seres vivos. Evidentemente fueron muchos los grupos que se lanzaron bien a confirmar, o bien a rechazar la hipótesis mediante la realización de diversos experimentos y observaciones.

Uno de esos grupos fue el del profesor James A. Lake, de la Universidad de California Los Angeles. Lake también se fijo en los ribosomas, pero en lugar de comparar sólo las secuencias de ARN ribosomal, se fijo en la estructura de la macromolécula completa. En concordancia a los resultados de Woese, encontró que los ribosomas bacterianos eran muy distintos de los ribosomas eucariotas y de las arqueas. Pero al comparar los ribosomas de eucariotas y arqueas se encontró con algo inesperado. Los ribosomas eucariotas se parecían bastante a un tipo de arqueas (las crenoarqueas pero en ese tiempo se las conocía como los eocitos), pero no a otro (las euryarqueas, el grupo de los metanógenos y los halófilos extremos).

Comparación de la estructura de los ribosomas provenientes de difrerentes tipos de células. Origen de la imagen: Lake et al. 1984


Así que propuso otra explicación para explicar el origen de los eucariotas: la hipótesis del eocito. La diferencia fundamental entre ambas hipótesis es la siguiente. El árbol de Woese consta de tres ramas principales: Bacteria, Archaea y Eukarya. El árbol de Lake solo consta de dos ramas: Bacteria y Archaea, y dentro de la rama "Archaea" los eucariotas serían una rama secundaria más.

Los dos árboles. A la izquierda los tres dominios propuestos por Woese, a la derecha los dos dominios propuestos por Lake. Modificado a partir de Cox et al. 2008


¿Quién tiene razón? Pues inicialmente la hipótesis que parecía más correcta era la de Woese, y de hecho es la que nos encontramos en los libros de texto más usados en microbiología como son el Brock y el Prescott. Pero desde la revolución genómica cada vez se están acumulando más datos de secuencias de genómas completos de diversos microorganismos y parece que es la hipótesis del eocito la que se está viendo confirmada, al menos según una reciente revisión que ha sido publicada en la revista Nature. Vamos a resumirla.

Las dos hipótesis enfrentadas. En el árbol de la izquierda tenemos tres dominios principales monofiléticos: Bacteria, Archaea y Eukarya. Este último también es conocido como el linaje del hospedador en referencia al evento endosimbiontico que dio origen a la mitocondira, o el linaje nuclear por la presencia de dicho orgánulo. En este árbol las arqueas y los eucariotas tienen un ancestro común que no comparten con las bacterias. Todas las arqueas están dentro de un grupo monofilético. En la hipótesis del eocito (árbol de la derecha), el linaje de los eucariotas es uno más dentro del linaje de las arqueas. De acuerdo con dicha hipótesis los eucariotas compartirían un ancestro común con uno o con todos los linajes del grupo TACK, pero estarían diferenciados del linaje de las arqueas metanógenas (las euryarqueas). Por eso las arqueas serían un grupo parafilético. En este árbol sólo hay dos grandes linajes: Bacteria y Archaea. Origen de la imagen: Williamns et al. 2013


Comparación de secuencias

El árbol de los tres dominios se vio apoyado inicialmente por los datos de comparación de secuencias debido a que había muy pocas disponibles. Como ya he comentado antes, cada vez se están acumulando más datos genómicos. Esa circunstancia ha obligado a desarrollar nuevos métodos de análisis bioinformático. En cierto sentido en el campo de la bioinformática esta pasando algo muy similar a lo del problema de la "clasificación del murciélago" (¿es un ave porque vuela o un mamífero porque tiene mamas?). Dependiendo del método de comparación o del gen que se compara, una serie de parecidos entre las secuencias parecen tener más peso que otros, y así uno puede conseguir que le salga un árbol de tres dominios o uno de dos dominios. Añadamos a eso que a veces pueden suceder artefactos debidos a la técnica experimental de comparación. Un ejemplo de eso es lo que se conoce como la "atracción de las grandes ramas" en las que las secuencias que están en el interior de una gran rama tienden a parecer mucho más relacionadas entre sí, independientemente de su historia evolutiva. Como los programas bioinformáticos son cada vez más refinados y están diseñados para evitar o minimizar esos artefactos, lo que se está viendo es que los árboles se ajustan mejor al modelo de dos ramas del eocito.


Comparación de los "Core-genes" implicados en la producción de proteínas

Cuando Woese eligió hacer la comparación usando el ARN ribosomal lo hizo porque esta molécula está presente en uno de los procesos más conservados de la vida: la biosíntesis proteica. Pero ahora se pueden comparar no sólo los ARN ribosomales, sino todas las proteínas que están involucradas en dicho proceso, sobre todo aquellas proteínas que forman parte del ribosoma. Es lo que se conocen como los genes principales o core-genes, y evidentemente están muy conservados. Se asume que son unos 39 genes (depende de las preferencias del investigador). Aunque aquí también hay problemas dependiendo del método de comparación que use. En un trabajo publicado en el 2001 se comparaban los genes y el cómo estaban agrupados y se postuló que el árbol del eocito era el correcto. Pero en el 2006 apareció otro trabajo en el que primero se alineaban las secuencias dentro de cada grupo (bacteria con bacteria, arquea con arquea y eucariota con eucariota) y luego se combinaban para la comparación final, obteniéndose así un árbol con tres dominios. Al igual de lo que se ha indicado en el apartado anterior, usando métodos de comparación más refinados, los árboles que se obtienen son de dos ramas y no de tres.


Nuevos linajes de arqueas

Una consecuencia del uso de métodos metagenómicos en el análisis de muestras ambientales es que nos ha permitido conocer la existencia de microorganismos que ni siquiera ha sido posible cultivarlos en el laboratorio. Y con ello han aparecido linajes totalmente nuevos que han permitido “romper” las grandes ramas. Es el caso de los phylum Korarchaeota, Thaumarchaeota y Aigarchaeota. Estos tres phylum están relacionados con el phylum Crenarchaeota, por lo que se les conoce de manera informal como el super-filum TACK para así distinguirlos de los Euryarchaeota. Pues bien, una gran parte de los genes homólogos entre los eucariotas y las arqueas está dentro de este grupo, incluyendo los homólogos de la actina y la tubulina, el sistema de la ubiquitina, y una gran parte de los genes de la maquinaria ribosómica. Sin embargo dichos parecidos no se encuentran en un solo representante del grupo TACK, sino que están repartidos entre todos ellos, lo que puede explicarse por procesos de pérdida de genes o por procesos de transferencia genética horizontal (HGT).

Relaciones entre las arqueas y el origen de los eucariotas. El árbol representado es la rama Archaea de acuerdo con la hipótesis del eocito. Algunas de estas pautas y homologías también pueden ser explicadas por la hipótesis de los tres dominios, pero los resultados metagenómicos más recientes parecen cuadrar más con esta representación. Así, todos los linajes del grupo TACK y los eucariotas comparten el hecho de tener una inserción en la secuencia del factor de elongación 1-alfa (la posición filogenética de Korarchaeum aún no está resuelta definitivamente, pero ese linaje se caracteriza por la pérdida de dicha inserción). Entre estos resultados recientes se incluyen los ortólogos de la actina y la tubulina que en los eucariotas son la base del citoesqueleto. En el caso de los euryarqueotas lo que se encuentra es FtsZ, el homólogo a la tubulina presente en las bacterias. También se han incluido los componentes del sistema de la ubiquitina encontrado en Caldiarchaeum subterraneum. Aunque los mayores parecidos entre eucariotas y el grupo TACK se encuentran al comparar las secuencias de los genes involucrados en la transcripción y la traducción (cuatro proteínas ribosomales, la subunidad RpoG de la RNApolimerasa y el factor de elongación Elf1). Origen de la imagen: Williamns et al. 2013


Endosimbiosis, procesos de transferencia genética horizontal e historia de la vida

Tanto la hipótesis de los tres dominios como la del eocito contemplan el cómo la endosimbiosis y los procesos HGT han influido en la evolución y en la aparición del linaje eucariota, pero se diferencian en el cuándo han sucedido. Lo que parece claro es que los genes involucrados en procesos de transcripción y traducción (core-genes) no se han visto afectados por procesos HGT tan frecuentemente como genes involucrados en procesos metabólicos, así que el estudio de cómo se heredaron de manera vertical nos debe de dar información sobre cuándo aparecieron los distintos linajes. Para la hipótesis de los tres dominios, la aparición de los eucariotas fue algo que sucedió muy tempranamente y por ello dicho linaje celular está al mismo nivel que el dominio Arquea. En cambio, según la hipótesis del eocito los eucariotas son un grupo relativamente joven ya que sus "core-genes" se originaron dentro del linaje Arquea.

En cuanto a la endosimbiosis que dio lugar a las mitocondrias y a los cloroplastos, parece claro que debió suceder después de que hubieran aparecido las alfaproteobacterias y las proclorofitas. Se ha llegado a postular que la endosimbiosis que dio lugar a las mitocondrias fue anterior a la aparición del núcleo, y que fue precisamente ese evento lo que originó la aparición del linaje eucariota. En ese caso, dicho evento tuvo que suceder mucho después de lo que indica el árbol con tres dominios, algo que se contempla en la hipótesis del eocito.


Registro fósil y aparición de los eucariotas

El primer fósil que es indiscutiblemente eucariota es un alga roja de las bangiophytas que ha sido datada entre los 1200 y los 720 millones de años. Hay sin embargo otros candidatos que aparecen en rocas con 1800 millones de años de edad. Esto es consistente con los datos de biología molecular que señalan que el último ancestro común de los eucariotas apareció entre los 1900 y los 1700 millones de años. Sin embargo, sabemos que los procariotas fotosintéticos que formaron los primeros estromatolitos aparecieron hace 3400 millones de años, y las primeras arqueas metanógenas (Euryarchaetoa) produjeron metano que quedó en el registro fósil hace ya 3500 millones de años. Esto indica que los dos linajes procariotas aparecieron casi dos mil millones de años antes de que aparecieran los eucariotas. De nuevo, este dato parece apuntar a la hipótesis del eocito más que a la de los tres dominios.

Moraleja, no te tatúes un árbol filogenético. Origen de la imagen: The Genealogical World


Membranas celulares

Este es el único aspecto que parece mejor explicado por el árbol de los tres dominios que por la hipótesis del eocito. Las bacterias y los eucariotas tienen en común que los fosfolípidos de sus membranas celulares presentan enlaces éster, mientras que los fosfolípidos de todas las arqueas contienen enlaces éter. Lo cierto es que la aparición de las membranas biológicas en la historia de la vida es un asunto que no está aún muy claro, y de hecho se ha llegado a proponer que la vida apareció en estructuras de origen mineral y que luego se formaron las membranas dando lugar a las células modernas. En el caso de la hipótesis del eocito habría que explicar como una arquea del grupo TACK que realiza una endosimbiosis con una alfaproteobacteria, cambió su sistema de membranas biológicas del "estilo arquea" al "estilo bacteria".


Conclusiones

Si el árbol del eocito es correcto, entonces el grupo TACK de las arqueas contiene las pistas para explicar el origen de los eucariotas y de las complejas estructuras intracelulares que contienen. Al mismo tiempo, permite rechazar la hipótesis de que los eucariotas son un linaje celular primordial, dejando tan solo dos dominios primarios: Archaea y Bacteria.


. ¡Que tengáis un feliz 2014!
Origen de la imagen: Zazzle


Esta entrada participa en el XXVII carnaval de la Biología alojado en el blog La aventura de la ciencia

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Woese CR, & Fox GE (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74 (11), 5088-90 PMID: 270744

Williams TA, Foster PG, Cox CJ, & Embley TM (2013). An archaeal origin of eukaryotes supports only two primary domains of life. Nature, 504 (7479), 231-6 PMID: 24336283

Cox CJ, Foster PG, Hirt RP, Harris SR, & Embley TM (2008). The archaebacterial origin of eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105 (51), 20356-61 PMID: 19073919

Lake JA, Henderson E, Oakes M, & Clark MW (1984). Eocytes: a new ribosome structure indicates a kingdom with a close relationship to eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81 (12), 3786-90 PMID: 6587394