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martes, 25 de septiembre de 2012

Phee ɸ Phoh PhuZ: El cuento del fago gigante y la tubulina furtiva

Masters of the Cytoskeleton. Uno de los accesorios del famoso juguete de Mattel era el "Battle Bones", un esqueleto que servía para organizar y transportar a los Masters del Universo a través de terrenos agrestes y llevarlos al combate. De manera análoga, unos recientes artículos han mostrado que determinados fagos codifican para proteínas citoesqueletales que organizan y transportan al DNA viral durante su replicación en el interior de la célula del hospedador.


Continuando con el tema de los virus, reproduzco la traducción de un interesante artículo escrito por Daniel P. Haeusser, investigador postdoctoral del laboratorio de W. Margolin en el Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Facultad de Medicina de Houston en la Universidad de Texas. El artículo se publicó en el blog Small Things Considered dirigido por Moselio Schaechter. Una versión más detallada del mismo puede encontrarse en Current Biology.



Hace unos pocos años atendí a una reunión de la ASM donde un investigador dio una charla sobre un muestreo metagenómico de los bacteriofagos de los océanos. En el típico estilo de dichos estudios, una de las diapositivas mostraba una lista de docenas de genes codificados en esos genomas virales. Con sorpresa noté que uno de ellos era ftsZ, que codifica para el homólogo procariota de la tubulina, responsable de la división celular en bacterias y en varios phyla de las arqueas. Me pregunté: ¿Para qué narices tiene un fago una proteína citoesqueletal? El gen ftsZ se encuentra incluso en los cloroplastos y las mitocondrias de ciertos protistas, pero al menos esos orgánulos tienen una historia evolutiva de haber sido unas células independientes. Pero con un virus no hay un “cito” en el cual colocar una “esqueleto”. Una hipótesis obvia es que el fago puede hacer uso de una proteína parecida a la tubulina dentro de su hospedador para así poder completar su malicioso ciclo reproductivo, pero ¿de qué manera?

Dos recientes estudios (Kraemer et al., and Oliva et al.) en los que se describe y caracteriza a unos homólogos de tubulina codificados por fagos, pueden ayudarnos en la respuesta. Gracias a esos trabajos emerge un modelo general para el papel de estas proteínas en la dirección de la replicación del DNA viral dentro del hospedador y en la proliferación de esos fagos. Curiosamente, los fagos que codifican para esos homólogos de tubulina poseen unos genomas muy grandes, sugiriendo una posible correlación entre un genoma de tamaño gigantesco y la necesidad de un citoesqueleto codificado por el fago.

Figura 1: La superfamilia de las tubulinas mostrando a sus nuevos miembros: PhuZ (verde) y el agrupamiento de Clostridium (azul oscuro) que incluye a la proteína parecida a TubZ del fago c-st. No se muestra el agrupamiento BtubAB (tubulina bacteriana). Fuente de la imagen: Kraemer et al.


Dentro de la super-familia de las tubulinas, los recientemente descritos homólogos virales de la tubulina caen en dos agrupamientos (clusters) filogenéticos únicos (Figura 1). Uno de los agrupamientos contiene a representantes provenientes de cromosomas, plásmidos o fagos del género Clostridium. El homólogo de la tubulina del estudio de Oliva et al. proviene del fago c-st de C. botulinum, un fago conocido por ser el productor de la toxina botulínica. La estructura cristalina de este homólogo de la tubulina revela una gran similaridad con la familia TubZ (figura 2), la cual está involucrada en la segregación de los plásmidos de bajo número de copia en las especies de Bacillus. En este sistema, la cola C-terminal de TubZ se une a Tub R, una proteína adaptadora que también se une a TubS, los sitios centroméricos en el DNA plasmídico.

Como el TubZ canónico, la proteína TubZ del fago c-st se ensambla en dos filamentos helicoidales en presencia de GTP. Además de codificar para un homólogo de TubZ y de TubR, el fago c-st también contiene un nuevo factor llamado TubY que Oliva et al. han caracterizado in vitro, como un fuerte modulador del ensamblaje de TubZ, capaza de despolimerizar y reestructurar los polímeros de TubZ. Ya que el fago c-st se replica como si fuera un plásmido, no debe sorprender que un sistema como TubZRS esté involucrado. Sin embargo, queda por determinar si la proteína TubZ del fago c-st puede formar filamentos in vivo o si este sistema presenta beneficios significativos para la reproducción del fago.

El segundo agrupamiento filogenético de los homólogos de tubulina codificados por fagos has sido bautizado como PhuZ, por “Phage tubulin/FtsZ”. Los representantes de esta familia son fagos que infectan al género Pseudomonas. La proteína PhuZ del fago 201ɸ2-1 que infecta a P. chloraphis es el objeto de estudio de Kraemer et al. Como TubZ, PhuZ se ensambla en presencia de GTP en una hélice con dos filamentos que se parecen a más a la f-actina que a la tubulina. Sin embargo, hay unas notables diferencias entre PhuZ y TubZ (Fig 2). PhuZ carece de una hélice interdominios que está conservada en los otros homólogos de tubulina y que es importante en la polimerización de los mismos. En su lugar, para conseguir la polimerización, PHuZ usa un “parche ácido” al final de su C-terminal. En el modelo propuesto por los autores, seis aminoácidos ácidos de los trece residuos que hay en el extremo C-terminal de un monómero de PhuZ forman un “nudillo” que se encaja en un “parche” básico formado por las hélices H3-5 del monómero adyacente, creando un patrón de superposición en la polimerización. La deleción del nudillo y la creación de mutaciones puntuales en sitios estratégicos anulan el ensamblaje de PhuZ in vitro, lo que apoya el modelo estructural. Así, en lugar de usar el C-terminal para interactuar con otros factores como hacen TubZ o FtsZ, o para aumentar las interacciones laterales, PhuZ parece emplear su cola para auto-interactuar en el ensamblaje de filamentos.

Figura 2: Comparación de las estructuras cristalinas de los distintos miembros de la superfamilia de las tubulinas: (A) El heterodímero de alfa/beta tubulina. (B) El heterodímero BtubA/B. (C) FtsZ. (D) TubZ. (E) PhuZ. (F) TubZ del fago c-st. Cada nombre lleva el enlace al origen de la imagen.


Kraemer et al. consiguieron determinar el papel de PhuZ in vivo de manera admirable. Sobreexpresaron la proteína de fusión GFP-PhuZ y observaron que forma filamentos dinámicos a lo largo de las células de P. chlororaphis (Figura 3). Los autores disminuyeron la expresión de GFP-PhuZ debajo del umbral en el que los filamentos podían observarse e infectaron a las bacterias con el fago 201ɸ2-1. Como resultado, la fluorescencia de los polímeros de PhuZ sólo se pueden formar cuando se sintetiza nuevo PhuZ por el fago. La fotomicroscopía a intervalos reveló que los filamentos de PhuZ se formaban y se mantenían hasta la lisis de la célula hospedadora. Al teñir el DNA se reveló una alta concentración de DNA viral encapsidado que formaba unas estructuras en roseta en medio de la célula con contactos en los extremos de los filamentos de PhuZ (figura 4). Al utilizar mutantes de PhuZ que forman filamentos no-dinámicos se observó que el DNA viral se localizaba erróneamente en los polos, o aparecía disperso en pequeños nucleoides y se reducía dramáticamente el reventón de la bacteria hospedadora durante la liberación de viriones comparado con una expresión de PhuZ normal. Este resultado sugiere que los filamentos de PhuZ ayudan a incrementar el rendimiento de producción de los fagos

Figura 3: GFP-PhuZ se ensambla en filamentos (quizás asociados a la membrana) cuando es sobreexpresada in vivo. Fuente de la imagen: Kraemer et al.


Asi que ¿Qué es lo que hace exactamente PhuZ para facilitar la replicación del DNA y la proliferación del fago? Una posibilidad es que directamente interacciona con el DNA del fago, o indirectamente a través de una proteína adaptadora como lo que hace TubZ con TubR. O el sistema puede ser incluso más complejo. En estudios con el fago ɸ29 de Bacillus se ha identificado una pequeña proteína "coiled coil" llamada p1, que se autoensambla en filamentos y hojas que también parece jugar un papel semejante en organizar la replicación del DNA viral. Además de la proteína p1, el fago ɸ29 expresa proteínas adicionales involucradas en este proceso que se unen al DNA viral y que depende para su localización y actividad, del citoesqueleto bacteriano formado por la proteína MreB. Así que PhuZ puede ser una parte individual de una aparato mucho mayor que incluye otras proteínas del virus y factores del hospedador.

Figura 4: Durante la infección del fago se pueden observar filamentos de GFP-PhuZ formados a cada lado de un nucleoide de DNA viral localizado en el medio de la célula. Las secciones a 450, 600 y 900 nm muestran la estructura en forma de roseta del nucleoide de DNA del fago. Fuente de la imagen: Kraemer et al.


La correlación entre el tamaño del genoma del fago y estas proteínas citoesqueletales codificadas por el fago es tentadora, pero el significado todavía no está claro. ¿Hay alguna necesidad inherente de organizar de una manera mejor un genoma grande dentro del hospedador comparado con uno pequeño? De ser así, ¿por qué debes de llevar tus propias proteínas citoesqueletales en lugar de hacer uso de las que ya tiene el hospedador como hacen muchos virus eucariotas? Quizás, el citoesqueleto del hospedador tenga preferencia por la regulación del ensamblaje del mismo y eso pueda perjudicar el objetivo del fago de lisar la bacteria. En lugar de luchar por el control del ensamblaje del citoesqueleto natural del hospedador, el usar tu propia proteína cuando y donde tú quieras puede ser una solución más sencilla, particularmente cuando tu genoma tiene el espacio suficiente para incluir esa información. Mientras éstas y otras preguntas son respondidas, la familia citoesqueletal seguramente seguirá creciendo, particularmente en la exploración del increíble campo de los fagos.

Esta entrada participa en el XVI carnaval de la Biología alojado en El Blog Falsable y en el XVII carnaval de la Química alojado en Un geólogo en apuros

ResearchBlogging.org

Kraemer JA, Erb ML, Waddling CA, Montabana EA, Zehr EA, Wang H, Nguyen K, Pham DS, Agard DA, & Pogliano J (2012). A phage tubulin assembles dynamic filaments by an atypical mechanism to center viral DNA within the host cell. Cell, 149 (7), 1488-99 PMID: 22726436

Oliva MA, Martin-Galiano AJ, Sakaguchi Y, & Andreu JM (2012). Tubulin homolog TubZ in a phage-encoded partition system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109 (20), 7711-6 PMID: 22538818