Un panal de antibiótico

La microscopía de fuerza atómica (AFM por sus siglas en inglés) es una de las herramientas más potentes en el estudio de las superficies de cualquier material. Así que no debe de sorprendernos que haya sido usada en el estudio de las envolturas virales y de las membranas biológicas. Una de sus grandes ventajas es que permite estudiar a las muestras biológicas in vivo y en tiempo real, por lo que pueden observarse fenómenos dinámicos como puede ser la división celular o el efecto de un antibiótico.

 
Eso es lo que han hecho en el grupo de Sebastian Hiller con la polimixina, un antibiótico con una estructura peculiar. En realidad sería más correcto hablar de "polimixinas", ya que hay diferentes tipos dependiendo de su composición. Una de las polimixinas más estudiadas es la E, también conocida como colistina, y cuya estructura se muestra abajo. Contiene diez aminoácidos, seis de los cuales son ácido 2,4-diaminobutírico, por lo cual tiene numerosas cargas positivas a pH 7. Siete de esos aminoácidos forman un anillo y los tres restantes forman una especie de cola. Es un polipéptido que no es sintetizado por ribosomas, sino por enzimas llamadas sintetasas que operan de manera secuencial engarzando los aminoácidos. Las últimas etapas son la ciclación y luego la adición posterior de un ácido graso.  

Estructura de la Polimixina E (Fuente: Wikipedia)

 

Las polimixinas son producidas por bacterias Gram positivas como Paenibacillus polymixa y su diana molecular es la membrana externa de las bacterias Gram negativas como Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa, aunque también puede afectar a la membrana citoplasmática. Está considerada como un antibiótico de último recurso para el tratamiento de infecciones por bacterias multirresistentes. Se asumía que las polimixinas actuaban como una especie de detergente que actuaba de la siguiente manera. Primero la parte ciclada se unía al lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa. Tras la unión, la cola hidrofóbica se integraría en la membrana provocando la desorganización de misma. Sin embargo había una serie de datos que parecían indicar que la polimixina actuaba de una forma distinta, como por ejemplo, que la concentración efectiva del antibiótico que se observa en suero no era lo suficientemente alta como para tener ese efecto detergente. 

Ese es el hueco que han conseguido rellenar con el artículo de Hiller. Para ello han usado a E. coli para preparar vesículas de membrana externa conteniendo LPS. Después han cogido esas vesículas y las han dispuesto sobre una superficie plana de mica. En esas condiciones las vesículas se disponen como un parche circular de unos 100 a 300 nanómetros. Si se observa con el AFM lo que se ve es una superficie lisa. Posteriormente añadieron la polimixina B a una concentración de 1 mg por litro. Lo que observaron es que en los parches se formaban unas estructuras laminares con un patrón de celdillas hexagonales. Esos "panales" sobresalen entre 1 a 1,2 nm sobre la superficie del parche de membrana y cada una de las celdillas que lo componen tiene una longitud de 10 nm.

 

Fotografía de parches de membrana externa antes (izquierda) y después de añadir polimixina E (derecha). Las barras de tamaño son de 200 nm en las fotos no ampliadas y de 20 nm en los zoom. Fuente Manioglu et al. 2022.

A continuación realizaron una serie de diversos experimentos para confirmar el resultado. En uno usaron una cepa resistente a polimixina cuyo LPS está alterado y presenta una reducción de su carga negativa con respecto al LPS presente en las cepas silvestres, por lo que el antibiótico no se une de manera eficiente. En ese caso lo que encontraron es que no se formaban las estructuras hexagonales y los parches mantenían la superficie lisa. En otros lo que hieron fue alterar químicamente el LPS y observaron que las estructuras laminares se alteraban. También comprobaron que dichas estructuras laminares se alteraban si lo que modificaban era la molécula de polimixina. Todos esos datos les llevaron a concluir que la polimixina no interacciona inespecíficamente con el LPS, sino que esas interacciones son muy específicas y han sido modeladas por la evolución. La unión de la polimixina disminuye el grosor, pero aumenta el área y la rigidez de la membrana externa, debilitándola y causando su ruptura. El modelo que proponen para explicar la acción de la polimixina es el siguiente.

 

Mecanismo de acción de la polimixina. Ver detalles en el texto. Fuente Manioglu et al. 2022. 

En primer lugar la polimixina interacciona electrostáticamente con el LPS de la membrana externa (1) . Posteriormente se forma la estructura cristalina hexagonal incrementándose la superficie de la membrana. Aunque esta estructura sobresale sobre la superficie, el groso de la membrana disminuye y además aumenta su rigidez (2). Estas alteraciones conducen a la formación de protusiones en la membrana (3a) y finalmente a su rotura (3b) causando la liberación del contenido periplásmico y que la polimixina pueda llegar al interior. Las alteraciones van progresando hasta llegar a la membrana citoplasmática, lo que causa la muerte de la bacteria. 

Como bien dicen en el artículo, han visto lo no visto. La AFM ha permitido conocer a escala nanométrica no solo la manera en la que la polimixina actúa, sino también cómo funciona un determinado mecanismo de resistencia. Algo muy importante en la actual lucha contra las bacterias multirresistentes.

Esta entrada ha sido traducida al inglés y publicada en el blog Small Things Considered.

Referencias bibliográficas

• Paiva, T.O., Viljoen, A. & Dufrêne, Y.F. Seeing the unseen: High-resolution AFM imaging captures antibiotic action in bacterial membranes. Nat Commun 13, 6196 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33839-z
• Manioglu, S., Modaresi, S.M., Ritzmann, N. et al. Antibiotic polymyxin arranges lipopolysaccharide into crystalline structures to solidify the bacterial membrane. Nat Commun 13, 6195 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33838-0