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viernes, 11 de julio de 2008

El Test de Fluctuación. Un experimento simple, sencillo y elegante

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El siguiente comentario no es mío. Pertenece al estupendo blog "The evilutionary biologist" escrito por John Dennehy, pero me ha parecido tan interesante que lo he traducido. Tiene mucho que ver con una entrada reciente, la dedicada a los experimentos sobre la evolución de Richard Lenski.


La cita clásica de la semana. El Test de Fluctuación.




Max Delbruck, Salvador Luria, and Frank Exner en el Cold Spring Harbor Laboratory.

Artículo Original:

Luria S. and Delbruck M. 1943. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 8: 491.

La cita clásica de la semana está dedicada a los premios Nóbel Salvador Luria y Max Delbruck y es uno de los más famosos experimentos de la Biología. Luria y Delbruck se preguntaban sobre la naturaleza de las mutaciones. ¿Eran espontáneas? O por el contrario ¿ocurrían en respuesta a las condiciones ambientales? Este último punto de vista, común en algunos científicos actuales (p. ej. Cyril Hinshelwood), fue uno de los últimos vestigios del Lamarckismo en la biología evolutiva.


Desde la época de
d'Herelle, se sabe que un cultivo de bacterias expuestas a la acción de un virus bacteriófago va perdidendo turbidez y clarificándose, como si todas las bacterias en dicho cultivo estuvieran muriendo (de hecho eso es lo que pasa). Sin embargo, algunas veces el cultivo vuelve a crecer y la turbidez reaparece. Se asumió que la bacteria adquiría una resistencia a la acción del fago y que era capaz de repoblar el cultivo. La pregunta era ¿cómo podía utilizarse dicho sistema para demostrar el papel del azar en las mutaciones?


Luria estuvo cavilando sobre el problema durante varios meses, intentando diseñar un experimento que demostrase si las mutaciones eran espontáneas o no. Entonces, en el transcurso de la celebración de un baile en la Universidad de Indiana, Luria tuvo su "momento eureka".


Durante una pausa de la música, me encontré observando a un colega que estaba echando monedas en una máquina tragaperras. A pesar de que perdía la mayor parte de las veces, ocasionalmente ganaba alguna moneda. Como no me gustan las apuestas, le sermoneé sobre la inevitabilidad de que iba a perder más dinero del que iba a ganar cuando de repente consiguió un pleno... recogió sus ganancias, me dirigió una mirada desafiante y se fue. En ese momento comencé a pensar sobre la numerología de las máquinas tragaperras. Al hacerlo me di cuenta de que las tragaperras y las mutaciones bacterianas tenían algo en común. (Extracto de la autobiografía de Luria: " Máquinas tragaperras y tubos de ensayo rotos")


Luria volvió a su laboratorio y preparó un gran número de cultivos bacterianos conteniendo cada uno de ellos una pequeña cantidad de inóculo. A cada uno de dichos cultivos le añadió un inóculo de bacteriófago (ver más abajo un esquema explicativo del experimento). Luria razonó de la siguiente forma: si las mutaciones se producían de manera dirigida como respuesta a la presencia del fago, tal y como el Lamarquismo supone, entonces el número de bacterias supervivientes debería ser muy parecido entre los cultivos, pues todos ellos producirían mutantes resistentes en pequeño número (Panel superior de la figura 1). Si por el contrario las mutaciones eran espontáneas, entonces su distribución sería al azar y serían semejantes a acertar un pleno en una máquina tragaperras. En ese caso, el número de bacterias supervivientes debería ser pequeño en la mayoría de los cúltivos, pero en algunos pocos cultivos dicho número de supervivientes debería ser grande (Panel inferior de la figura 1).





Figura 1: Resultados esperables en el caso de que la mutación fuera dirigida (caracter post-adaptativo) por un cambio ambiental, o si fuera espontánea (caracter pre-adaptativo). El cambio ambiental en el experimento de Luria y Delbruck consistía en la adición de un virus bacteriófago (línea de puntos). En rojo se indican las bacterias resistentes. En el caso de que la mutación fuera como una adaptación fisiológica (arriba) las medias y la varianza son muy parecidas. Si la mutación es al azar (abajo) las medias y varianzas son muy desiguales



Debajo se muestra la figura 2 del artículo original de Luria y Delbruck. En ella puede verse que el número de "plenos" (>9 resistant bacteria) es mayor que el esperado. Los experimentos de Luria y Delbruck demostraron inequivocamente que las mutaciones eran espontáneas y mostraron la importancia del papel del azar y de la historia de un ser vivo en la biología evolutiva clavando el último clavo en el ataud del lamarquismo (*).


La razón por la que se ha seleccionado el Test de Fluctuación como la cita clásica de la semana es por un reciente intercambio de impresiones con Rich Lenski de las que parte de ellas son reproducidas a continuación.

Siempre me ha fascinado la tensión entre el azar y la necesidad, entre la suerte y la repetibilidad. De niño adoraba los juegos con dados y cartas que requerían suerte y habilidad al mismo tiempo. Posteriormente, cuando asistí al Oberlin College, me matriculé en un maravilloso curso en el que el libro de texto utilizado era el libro "Molecular Genetics: an Introductory Narrative" de Gunther Stent. Al contrario que otros libros de ciencia, este se centraba en la historia de quién hacia un experimento y porqué lo hacia. Recuerdo la lectura sobre el "test de Fluctuación" desarrollado por Salvador Luria y Max Delbruck y como trataban de darle sentido y de repente teniendo aquel "momento eureka" cuando todo el experimento cobró sentido ante mi. Es mi experimento favorito de todos los tiempos, y hasta el día de hoy, cuando pienso en él, aun me maravillo no solo por su elegancia, sino también por la sutileza de la onterpretación y por la apreciación del porqué de la dificultad del problema hasta que ellos realizaron el experimento. Como bien sabes, uno de los puntos principales del Experimento de Evolución a Largo Plazo con E. coli es entender la repetibilidad de la evolución que surge de la tensión entre mutación al azar por un lado y el proceso sistemático de la selección natural por el otro lado. Esto empuja a las poblaciones hacia una mayor aptitud (fitness) en los ambientes en los que ellas viven. Luego, en un cierto sentido, uno puede pensar que mi Experimento de Evolución a Largo Plazo es un descendiente del Test de Fluctuación. Un descenciente que examina el papel de la mutación al azar en producir variación estadisticamente cuantificable entre linajes replicados, no en cultivos overnight (**), sino entre cultivos con más de 40.000 generaciones de evolución separada.


Es precisamente esta azarosidad de la evolución la que ha conducido a Lenski y sus colegas a su último descubrimiento, en el que tras 33127 generaciones, una cepa de E. coli ha evolucionado y ahora es capaz de asimilar el citrato. Carl Zimmer fue el que cubrió dicha
historia.


Lenski ha tenido también una reciente discusión con los IDiots(***), y su tolerante respuesta puede encontrarse aquí.


Hasta aquí el comentario de John Dennehy. Algunas aclaraciones para los no expertos en Biología o aquellos estudiantes que aun no les hayan explicado el famoso experimento.


- Una página web de la Universidad Complutense bastante buena sobre la mutación.


- El experimento de Luria y Delbruck:

Luria tomó una colonia y con ella estableció dos cultivos. El cultivo A lo dividió a su vez en 20 cultivos más pequeños. Los 21 cultivos (20 cultivitos A más el cultivo B) y se dejaron crecer durante toda la noche (overnight). Al día siguiente se tomó una muestra de cada uno de los 20 cultivos A y se le añadio el bacteriófago. El cultivo B fue dividido en 20 alícuotas y a cada una de ellas se le añadió el bacteriófago. Posteriormente se determinó el número de bacterias resistentes al fago en los cultivos A y en los cultivos B. Tal y como se ha explicado antes, si la mutación fuera una adaptación fisiológica las medias y varianzad de los cultivos A serían similares a las de las muestras del cultivo B. Sin embargo los resultados fueron muy diferentes, luego la mutación era al azar y tenía un carácter post-adaptativo


(*) Desafortunadamente el Lamarckismo se resiste a morir. De vez en cuando se lee alguna noticia sobre la herencia de caractéres adquiridos que luego queda desacredita, por lo que el experimento de Luria y Delbruck no es el "último clavo".

(**)Cultivo overnight. En los laboratorios que trabajan con la bacteria E. coli generalmente se suele inocular el cultivo por las tardes y se deja crecer el cultivo durante toda la noche (overnight). Generalmente han pasado al menos unas 20 a 30 generaciones y el cultivo suele encontrarse en la fase estacionaria.

(***) IDiots. ID = Inteligent Design. He optado por dejar el termino original. Es una forma despectiva de referirse a los defensores del Diseño Inteligente. Aunque considero que en el plano científico el Diseño Inteligente es una tontería del mismo calibre que aquellos que defienden que la Tierra es plana, también pienso que utilizar un término despectivo para referirse a aquellos que no comparten nuestro punto de vista es caer en un error bastante grave.



Audio en "El podcast del microbio"


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9 comentarios:

David Talens Perales dijo...

Lástima no haber hecho una entrada antes de este tema porque la pregunta me salió en el exámen de genética!!! pero bueno la resolví sin problema.

Manuel Sánchez dijo...

Gracias por el comentario David. Espero que hayas tenido suerte con los exámenes.

Muñeco dijo...

Buen dia!!! sabes es muy interesante este articulo; solo que ami no me queda claro el porque adicionar el fago en la fase estacionaria??????
mas sin embargo seguire estudiandolo!!!!
Me agrada poder dejar comentarios sobre articulos como este y cabe mencionar que este es el articulo que tendra el primero de muchos comentarios que hare de algo importante. espero estar en contacto!! y si alguien me puede ayudar se lo agradeceria con todo gusto. ojala pudieran publicar algun tema sobre ¿como eliminar a los bacteriofagos??? para mi seria de suma importancia.
Gracias y estoy para servirles!!!

Manuel Sánchez dijo...

Gracias por el comentario Muñeco. El fago no se añade en fase estacionaria, sino en la exponencial.

Tal y como dice el post el cultivo es un overnight del cual se toma una pequeña alícuota y se diluye en medio fresco. Probablemente le dejan crecer algo en el medio antes de añadir el fago.

Muñeco dijo...

Hola de nuevo!! sabe ya le habia dicho que es un articulo muy interesante; no se si ud me podria mensionar algun articulo que me sirva como guia para saber como eliminar bacteriofagos!!!!!
De antemano le mando un coordial saludo esperando que goze de una excelente salud.
Para cualquier duda o cementario estoy a sus ordenes.

Manuel Sánchez dijo...

Buenas

Muñeco, la respuesta a tu pregunta es un "Depende de dónde quieras eliminarlos".

Si lo quieres hacer sobre isntrumental de laboratorio o en medios de cultivo bacteriano (como el LB o similar) el modo más fácil y barato es el autoclavado. Generalmente 121ºC y una sobrepresión de 1,2 atmósferas durante 20 minutos acaban desnaturalizando las proteínas por lo que cualquier virión sería destruido.

Si es otro tipo de material más delicado o son muestras ambientales entonces el problema puede ser algo más complejo.

¿Puedes ser más preciso?

Shaúl Navarro dijo...

Excelente entrada hermano, sin duda todo lo relacionado con la biología molecular es hermoso (Y)

Francisco dijo...

A pesar de que el experimento de Luria y Delbruck muestra resultados irrefutables en apariencia, la realidad es otra, Joseph Cairns descubre en 1988 que si no se cambian drásticamente las condiciones del medio de cultivo. esto da como resultado que las mutaciones no se llevan a cabo por azar sino de manera adaptativa. Ya se vino abajo el neodarwinismo con la actual teoría epigenética, incluso el dogma de la biología molecular, teniéndose que retomar nuevamente el lamarckismo. recientemente se ha evidenciado categóricamente que en C. Elegans, las mutaciones en células nerviosas pueden pasar a las células germinales y esta mutación se establece por generaciones. ¿Darwin ha muerto?

Manuel Sánchez dijo...

Buenas

Francisco, ¿Dónde está la referencia de Cairns que apoya lo que dices?

Saludos