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martes, 6 de diciembre de 2022

De los trasplantes de heces a la terapia de reemplazo de microbiota.


Clostidioides difficile. Fuente: Wikipedia


Hace unos meses comentaba en un artículo el uso de los trasplantes fecales para el tratamiento de las infecciones producidas por la bacteria Clostridioides difficile (antes conocida como Clostridium difficile). Aunque los trasplantes de heces están reconocidos como una terapia efectiva, no todo son ventajas.

Uno de los problemas es que los excrementos deben provenir de un donante sano. Otro es que deben ser analizados y procesados para asegurarse de que no presentan microorganismos potencialmente patógenos. Y por si fuera poco, cada donante tiene su propia microbiota, por lo que la variabilidad es enorme.

El tratamiento de las infecciones por C. difficile, que causan diarreas y colitis, se simplificaría bastante si los médicos dispusieran de una preparación de bacterias con el potencial terapéutico deseado y que su seguridad y su eficacia estuvieran garantizadas. Es decir, conseguir un biofármaco diseñado para desplazar al microorganismo patógeno.


Artículo completo en The Conversation. Para seguir leyendo sigue este enlace.

viernes, 28 de octubre de 2022

Un panal de antibiótico



La microscopía de fuerza atómica (AFM por sus siglas en inglés) es una de las herramientas más potentes en el estudio de las superficies de cualquier material. Así que no debe de sorprendernos que haya sido usada en el estudio de las envolturas virales y de las membranas biológicas. Una de sus grandes ventajas es que permite estudiar a las muestras biológicas in vivo y en tiempo real, por lo que pueden observarse fenómenos dinámicos como puede ser la división celular o el efecto de un antibiótico.
 
Eso es lo que han hecho en el grupo de Sebastian Hiller con la polimixina, un antibiótico con una estructura peculiar. En realidad sería más correcto hablar de "polimixinas", ya que hay diferentes tipos dependiendo de su composición. Una de las polimixinas más estudiadas es la E, también conocida como colistina, y cuya estructura se muestra abajo. Contiene diez aminoácidos, seis de los cuales son ácido 2,4-diaminobutírico, por lo cual tiene numerosas cargas positivas a pH 7. Siete de esos aminoácidos forman un anillo y los tres restantes forman una especie de cola. Es un polipéptido que no es sintetizado por ribosomas, sino por enzimas llamadas sintetasas que operan de manera secuencial engarzando los aminoácidos. Las últimas etapas son la ciclación y luego la adición posterior de un ácido graso.  

Estructura de la Polimixina E (Fuente: Wikipedia)

 

Las polimixinas son producidas por bacterias Gram positivas como Paenibacillus polymixa y su diana molecular es la membrana externa de las bacterias Gram negativas como Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa, aunque también puede afectar a la membrana citoplasmática. Está considerada como un antibiótico de último recurso para el tratamiento de infecciones por bacterias multirresistentes. Se asumía que las polimixinas actuaban como una especie de detergente que actuaba de la siguiente manera. Primero la parte ciclada se unía al lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa. Tras la unión, la cola hidrofóbica se integraría en la membrana provocando la desorganización de misma. Sin embargo había una serie de datos que parecían indicar que la polimixina actuaba de una forma distinta, como por ejemplo, que la concentración efectiva del antibiótico que se observa en suero no era lo suficientemente alta como para tener ese efecto detergente. 

Ese es el hueco que han conseguido rellenar con el artículo de Hiller. Para ello han usado a E. coli para preparar vesículas de membrana externa conteniendo LPS. Después han cogido esas vesículas y las han dispuesto sobre una superficie plana de mica. En esas condiciones las vesículas se disponen como un parche circular de unos 100 a 300 nanómetros. Si se observa con el AFM lo que se ve es una superficie lisa. Posteriormente añadieron la polimixina B a una concentración de 1 mg por litro. Lo que observaron es que en los parches se formaban unas estructuras laminares con un patrón de celdillas hexagonales. Esos "panales" sobresalen entre 1 a 1,2 nm sobre la superficie del parche de membrana y cada una de las celdillas que lo componen tiene una longitud de 10 nm.

 
Fotografía de parches de membrana externa antes (izquierda) y después de añadir polimixina E (derecha). Las barras de tamaño son de 200 nm en las fotos no ampliadas y de 20 nm en los zoom. Fuente Manioglu et al. 2022.


A continuación realizaron una serie de diversos experimentos para confirmar el resultado. En uno usaron una cepa resistente a polimixina cuyo LPS está alterado y presenta una reducción de su carga negativa con respecto al LPS presente en las cepas silvestres, por lo que el antibiótico no se une de manera eficiente. En ese caso lo que encontraron es que no se formaban las estructuras hexagonales y los parches mantenían la superficie lisa. En otros lo que hieron fue alterar químicamente el LPS y observaron que las estructuras laminares se alteraban. También comprobaron que dichas estructuras laminares se alteraban si lo que modificaban era la molécula de polimixina. Todos esos datos les llevaron a concluir que la polimixina no interacciona inespecíficamente con el LPS, sino que esas interacciones son muy específicas y han sido modeladas por la evolución. La unión de la polimixina disminuye el grosor, pero aumenta el área y la rigidez de la membrana externa, debilitándola y causando su ruptura. El modelo que proponen para explicar la acción de la polimixina es el siguiente.

 
Mecanismo de acción de la polimixina. Ver detalles en el texto. Fuente Manioglu et al. 2022


En primer lugar la polimixina interacciona electrostáticamente con el LPS de la membrana externa (1) . Posteriormente se forma la estructura cristalina hexagonal incrementándose la superficie de la membrana. Aunque esta estructura sobresale sobre la superficie, el groso de la membrana disminuye y además aumenta su rigidez (2). Estas alteraciones conducen a la formación de protusiones en la membrana (3a) y finalmente a su rotura (3b) causando la liberación del contenido periplásmico y que la polimixina pueda llegar al interior. Las alteraciones van progresando hasta llegar a la membrana citoplasmática, lo que causa la muerte de la bacteria. 

Como bien dicen en el artículo, han visto lo no visto. La AFM ha permitido conocer a escala nanométrica no solo la manera en la que la polimixina actúa, sino también cómo funciona un determinado mecanismo de resistencia. Algo muy importante en la actual lucha contra las bacterias multirresistentes.


Esta entrada ha sido traducida al inglés y publicada en el blog Small Things Considered.


Referencias bibliográficas
  • Paiva, T.O., Viljoen, A. & Dufrêne, Y.F. Seeing the unseen: High-resolution AFM imaging captures antibiotic action in bacterial membranes. Nat Commun 13, 6196 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33839-z
  • Manioglu, S., Modaresi, S.M., Ritzmann, N. et al. Antibiotic polymyxin arranges lipopolysaccharide into crystalline structures to solidify the bacterial membrane. Nat Commun 13, 6195 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33838-0

martes, 16 de agosto de 2022

El mito de la caca de camello, las diarreas y el Afrika Korps.

 



Una de las historias más curiosas de la Segunda Guerra Mundial es la de que las tropas del Afrika Korps imitaron el tratamiento que usaban los beduinos del desierto para combatir la diarrea, y que no consistía en otra cosa que en ingerir heces frescas de camello. De hecho esa historia aparece en varios artículos científicos sobre microbiota, e incluso se relata que los microbiólogos alemanes consiguieron aislar una cepa de Bacillus subtilis como responsable del efecto terapéutico que llegaron a producir en masa. 

Como buen friki de la microbiología y de la 2GM conocía la historia y pensé en introducirla en el artículo que recientemente he escrito para The Conversation sobre el posible uso del trasplante autólogo de heces para intentar "rejuvenecer". Así que me puse a buscar las referencias bibliográficas sobre dicha historia y empecé a notar algo raro. No encontraba ningún artículo en alemán y sobre todo, no encontraba ni una sola referencia a la producción a gran escala de Bacillus subtilis por microbiólogos alemanes durante la 2GM. El caso es que finalmente decidí no incluir ninguna mención de la historia de la caca de camello en el artículo porque pensaba buscar algo más sobre el tema. 

Bueno, pues según un reciente artículo publicado en PLOS-One todo el asunto de las cacas de camello, el Afrika Korps y Bacillus subtilis no es más que un mito. Los autores no solo se han dedicado a bucear en las bibliotecas y han comprobado que la "historia" nació en una revisión del año 2001 escrita por Ralph A. Lewin y titulada “More on Merde”. En dicha revisión se cita como fuente original un blog alemán ya desaparecido, pero que los autores han conseguido recatar gracias a la Wayback Machine. 

Pero los autores no se han quedado ahí. Como buenos científicos han intentado ver si la historia podía ser pausible. Así que se pusieron a ver el contenido de Bacillus subtilis en heces de dos dromedarios para ver si podrían tener un efecto terapéutico. ¿Qué han encontrado? Pues haciendo análisis con el 16S rRNA lo detectaban a niveles muy bajos (ver figura). Y cuando realizaban cultivos de esporas entonces sí que lo encontraban, pero a unos niveles bajísimos. En resumen, Bacillus subtilis no está en forma vegetativa en las heces de camello, tan solo en esporas y en muy bajo nivel.


Análisis de la microbiota de las heces de dos dromedarios para comprobar la presencia de la familia Bacillaceae. En el primero la abundancia relativa de dicha familia es de 0,08 y en el segundo de 0,16. Fuente: Koopman et al. 2022.


Así que los nazis serían unos comemierdas, pero no de camello.


¿Son nuestras heces el elixir de la juventud?



Hace unos 1 700 años al médico chino Ge Hong se le ocurrió que una forma de tratar la diarrea era dar a sus pacientes una “sopa amarilla” hecha a partir de heces frescas de un donante sano. La cosa debió de funcionar, porque para el siglo XVI los médicos chinos elaboraban diferentes “sopas amarillas” y “siropes dorados” que podían utilizarse para el tratamiento de distintas dolencias intestinales o intoxicaciones alimentarias.


Si quieres seguir leyendo, el resto del artículo está publicado en The Conversation. Comento los recientes resultados que se describen en este artículo científico del cual he sacado la imagen que aparece en la cabecera.


El tema de los trasplantes de heces ya ha aparecido en el blog en otras ocasiones.

lunes, 25 de julio de 2022

El blog ya tiene su primer libro



Hace unos días la Editorial de la UMH me publicó en formato de libro electrónico el primer recopilatorio de algunas de las entradas del blog.

El libro se puede descargar de manera gratuita aquí.

Espero que lo disfrutéis.




 

viernes, 11 de febrero de 2022

La historia de Margaret Hutchinson Rousseau

Margaret Hutchinson Rousseau (origen de la imagen: Wikipedia)


Ya vimos en el blog que en 1941 la manera de producir penicilina a gran escala era utilizar unos recipientes inspirados en las cuñas urinarias. Los recipientes se rellenaban hasta la mitad de medio de cultivo para maximizar la superficie de contacto con el aire. Luego se inoculaba el hongo, que crecía sobre dicha superficie originando un micelio flotante. La penicilina secretada por el hongo se iba acumulando en el medio de cultivo. Pasados unos cuantos días, el contenido se filtraba para separar el micelio del medio de cultivo. Ese medio era procesado posteriormente para purificar la penicilina. La tarea era bastante lenta y laboriosa, con el riesgo de que se todo se echara a perder por las altas probabilidades de contaminación, ya que se mezclaban el contenido de diferentes recipientes. Además, el rendimiento no era muy elevado. Más o menos, de cada botella se extraía el contenido de una dosis (ver el vídeo).



Todo el mundo tenía muy claro que había que encontrar un procedimiento que aumentara significativamente la producción de penicilina, pero no parecía un problema sencillo. Al contrario que lo que ocurre con la fermentación alcohólica en la que las levaduras producen etanol en condiciones anaerobias, el hongo Penicillium chrysogenum solo produce penicilina si forma un micelio y si además tenía aire en abundancia, por lo que no se puede producir el antibiótico en grandes recipientes similares a los que se usan para producir cerveza.

Cartel de propaganda para animar a los trabajadores a acondicionar lo más rápidamente posible la antigua fábrica de hielo donde albergarían los fermentadores para producir la penicilina (Fuente: The Chemicla Engineer)


Una de las personas que estuvo involucrada en la resolución del problema fue Margaret Hutchinson. Nacida en la ciudad de Houston en 1910 era hija de un ingeniero químico que trabajaba en la industria del petróleo. Se graduó en ciencias en el instituto Rice a los 22 años y consiguió su doctorado en el MIT en ingeniería química en el año 1937. La especialidad de Margaret eran los procesos de transferencia de masas entre fases gaseosas y líquidas. Sin ir más lejos, su tesis se titulaba “The effect of solute on the liquid film resistance in gas absorption” y en ella lo que estudió fue la resistencia a la absorción de ocho gases distintos -oxígeno, hidrógeno, dióxido de carbono, acetileno, nitrógeno. helio, dióxido de azufre y cloro - en agua con diferente grado de turbulencia. Fue la primera mujer en conseguir el doctorado en dicha disciplina en los Estados Unidos. La contrató la compañía E.B. Badger y dos años después se casó con un compañero de trabajo, el ingeniero William Caubu Rousseau, con el cual tuvo un hijo. 


Figura 2 de la tesis de Margaret Hutchinson en la que se muestra la relación entre la absorción de un gas (eje Y) y la velocidad de agitación del agua. Nótese que ambos ejes están en escala logarítmica (Fuente: MIT)


A finales de los años 30 el ambiente era prebélico y todos los países avanzados estaban desarrollando numerosos proyectos con vistas a su aplicación militar. La compañía E.B. Badger no era una excepción y Margaret estuvo involucrada en dos proyectos estratégicos: la síntesis de caucho sintético para fabricar neumáticos y la producción de gasolina de alto octanaje para aviación. Pero mucho más importante que el material de guerra es el cuidado de los soldados que manejan las armas. Y la penicilina podría salvar a millares de ellos de la muerte por infección de sus heridas. No es de extrañar que fuera necesario involucrar a las 21 empresas farmacéuticas norteamericanas de la época, incluidas los cuatro gigantes Merck, Squibb, Pfizer y Lederle.

Jasper Kane y John McKeen. Origen de la imagen: The Chemical Engineer.


La compañía Pfizer decidió apostar por la producción de penicilina en tanques con aireación ya que tenía experiencia en el crecimiento del hongo Aspergillus niger para la producción de ácido cítrico y de ácido glucónico. Jasper Kane era el director de investigación de Pfizer y encomendó al ingeniero John McKeen el diseño de una planta para producir penicilina. El problema era que debido a la guerra había escasez de materiales estratégicos y no era posible construir nuevos fermentadores y depósitos de acero. Así que a principios de 1943 se les ocurrió comprar una antigua fábrica de hielo situada en Brooklyn. McKeen se las vio y deseó para conseguir el equipamiento necesario para transformar la fábrica. Trabajando 7 días a la semana y 16 horas al día se consiguió que el 1 de marzo de 1943 se iniciara la primera fermentación de 28,400 litros de P. chrysogenum. Margaret Hutchinson fue contratada por Pfizer y trabajó en el establecimiento de los parámetros que permitían una correcta transferencia del oxígeno del aire al medio de cultivo que contenía al hongo. El proceso era tan eficiente que a finales de año la producción de penicilina de Pfizer superaba al resto de compañías farmacéuticas. El 6 de junio de 1944, día del desembarco de Normandía, el 90% de los dos millones trescientas mil dosis de penicilina suministradas a las tropas aliadas, provenían de la compañía Pfizer. 


Folleto de la American Chemical Association dedicado a la planta de producción de penicilina en Brooklyn, que tiene status de monumento histórico (fuente: ACS)


En 1945 Margaret Hutchinson fue la primera mujer en ser miembro del American Institute of Chemicals Engineers (AIChE) y posteriormente elegida como “fellow” de dicha sociedad. En el año 1983 fue galardonada con el premio Fundadores de la AIChE, su más alto honor. Falleció en el año 2000 a la edad de 89 años. En el año 2017 la AIChE estableció el premio Margaret Hutchinson para Ingenieras Químicas y Frances Arnold fue la primera en ganarlo. En el 2018 Frances Arnold ganó el premio Nobel de Química por sus trabajos en evolución in vitro de las enzimas.

Margaret Hutchinson en 1961 (Reuther Library. Fuente AIChE)

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