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sábado, 9 de marzo de 2019

La lógica del Cello



Poco a poco la Biología Sintética está tomando cuerpo como una disciplina que se va a poner al mismo nivel que la Bioquímica, la Genética o la Microbiología. Aunque algunos la han definido como una especie de Ingeniería Genética 2.0 en realidad la Biología Sintética es mucho más que eso. Podría ser definida como el uso de los principios de la Ingeniería para entender, diseñar y ensamblar componentes biológicos y conseguir nuevas utilidades y/o propiedades (*). Uno de los campos con mayor proyección es el desarrollo de circuitos genéticos para la programación celular. Hay que tener en cuenta que cualquier célula es capaz de tomar decisiones para responder a los cambios en su medio ambiente. Esa capacidad existe gracias a que las células poseen una serie de rutas que regulan el comportamiento de genes y proteínas. Ejemplo, si Escherichia coli detecta que hay lactosa en el medio activará la expresión de los genes que codifican para las enzimas necesarias para metabolizar ese azúcar. Es lo que conocemos como el operon lac, un circuito genético que ha sido desarrollado por la Evolución biológica.



Desde hace tiempo tenemos la capacidad tecnológica de construir circuitos genéticos para que las células respondan a las señales que nosotros pongamos en su entorno y así generar la respuesta metabólica que nosotros deseemos. Es decir, podemos rediseñar los sistemas biológicos naturales ya existentes para que hagan algo útil que nosotros queramos. Un paso más en la revolución biotecnológica actual. Evidentemente el primer paso para construir un circuito genético es diseñarlo. Hay varias formas de hacerlo pero una de las más sencillas es la descrita por el grupo liderado por Christopher A. Voight. En el 2016 publicó el artículo “Genetic circuit design automation” (DOI: 10.1126/science.aac7341) en el que se describía la web Cello (www.cellocad.org). Esta web es un entorno virtual en el que se aplican los principios del diseño de circuitos electrónicos basados en la lógica booleana para generar circuitos genéticos. Para ello usa un lenguaje de programación usado por los ingenieros electrónicos, el lenguaje Verilog, para el diseño de puertas lógicas del tipo NOT/NOR. Ese tipo de puertas lógicas tiene su equivalente biológico en los sistemas de proteínas represoras/activadoras de la transcripción. En el artículo además describían el desarrollo de una librería de "biobricks" que representaban a esas puertas lógicas y que podían ser interconectadas para formar el circuito genético que quisiéramos. Una vez diseñado el circuito genético el entorno Cello te proporciona la secuencia de DNA completa de dicho circuito, cómo debe diseñarse el plásmido donde clonar el circuito, los resultados esperados en el nivel de expresión de la proteína actuadora por número de células, etc. Todo listo para clonar en E. coli y que el circuito funcione. En el siguiente vídeo el propio Christopher A. Voight explica con detalle lo que hicieron.



Pues bien, este año he considerado que había que introducir algo más de Biología Sintética en el temario de la asignatura de Microbiología Industrial que se imparte en 2º curso del grado de Biotecnología de la UMH. Así que decidí que aprender a usar el entorno Cello podía ser una práctica de informática bastante interesante. Los resultados de la experiencia está comentada en el blog de la asignatura, aquí lo que voy a comentar es cómo me he manejado con dicho entorno y cuál es su potencial como herramienta para diseñar circuitos genéticos.

Como he dicho antes el entorno Cello utiliza el lenguaje de programación Verilog, y si uno se mira algo de dicho lenguaje lo primero que piensa es que no va a poder entenderlo. Sin embargo es más sencillo de lo que parece ya que en realidad los circuitos biológicos no son tan variados como los circuitos electrónicos así que uno puede hacerse unas "plantillas" con los programas que vienen descritos en el artículo de Voight (más abajo he puesto dos ejemplos). En dicho artículo se describen 45 circuitos genéticos distintos que han comprobado que funcionan in vivo. Lo siguiente que tiene que hacer el usuario de Cello es establecer las condiciones previas (en el entorno Cello se denominan UCF por “user constraints file”) como son el tipo de microorganismo que se va a usar, qué tipo de sensores va a disponer - ej: presencia/ausencia de arabinosa - y finalmente qué tipo de “actuador” - ej: expresión de Proteína Verde Fluorescente - está bajo el control del circuito genético que va a diseñarse. Una vez establecidas estas condiciones previas, se debe de establecer la llamada “tabla de la verdad” del circuito lógico. Esa tabla se introduce en la plantilla Verilog que le corresponda. Una vez hecho esto, el entorno Cello diseña automáticamente la secuencia de DNA que codifica para el circuito deseado. También hay que decir los problemas. El primero es que el servidor es bastante lento (lo cual es un problema para la realización de una práctica). El segundo es que el correo de asistencia técnica no funciona (o al menos a mí nunca me han respondido).

El trabajo del grupo de Voight no es interesante solo por el hecho de haber desarrollado el entorno Cello. Lo más interesante es que han conseguido aislar cada una de las "puertas lógicas genéticas" para que no se produzcan cortocircuitos. En un circuito electrónico es fácil aislar los diodos y los resistores y construir el circuito en dos dimensiones. La electricidad recorre el material conductor y ya está. Pero en los circuitos genéticos todos los componentes están en una dimensión y están hechos del mismo material (DNA y proteínas). En un ser vivo las señales de entrada/salida (inputs/outputs) no son electrones, son flujos de la RNA polimerasa. T las puertas lógicas NOT/NOR no son diodos o resistores, son genes, promotores, proteínas represoras, secuencias de unión de ribosomas, y se aíslan entre si gracias a terminadores de transcripción fuertes. De esa forma se puede intercambiar entre sí y así construir circuitos complejos. Algunos de ellos están compuestos por 10 reguladores y 55 partes y su funcionalidad es del 92% de lo predicho.

La Puerta NOR representada con el símbolo ANSI de la esquina superior izquierda, es una puerta lógica que implementa la disyunción lógica negada. Esto quiere decir que se comporta de acuerdo a la tabla de verdad mostrada debajo de dicho símbolo. En la parte inferior izquierda se muestra la programación en Verilog de dicha puerta. Nótese como están codificadas las entradas y las salidas (por ejemplo la entrada  "0,0" y salida "1" es la línea 2'b00: {out} = 1'b1; ). En la parte central se representa el diagrama electrónico en la parte superior y la disposición física CMOS en un circuito integrado. A la derecha se representa el circuito genético completo que codifica para la puerta NOR. Hay dos genes sensores, los represores LacI y TetR (arriba), la puerta NOR que consiste en el gen del represor PhlF bajo el control de los promotores Ptac y Ptet (centro) y el gen actuador o reporter (debajo) que consiste en una proteína fluorescente controlada por el promotor PPhlF. Los símbolos que aparecen siguen la normativa SBOL. Más detalles del funcionamiento en el texto.La imagen es una composición realizada a partir de material de la Wikipedia, del artículo de Voight et al. y del resultado del programa Cello


Vamos a ver como se construye una puerta NOR con un circuito genético. En la imagen de arriba está representado el circuito. Como vemos en la tabla de la verdad, la puerta NOR da un resultado de "1" cuando no hay ninguna entrada. Si hay alguna entrada, entonces la salida es "0". En el circuito biológico, los genes sensores son los represores LacI y TetR. Como vemos se están expresando constituitivamente luego esas proteínas siempre están presentes. En la situación "0,0" significa que no hay ningún estímulo y ambos represores se unen a los promotores Ptac y Ptet, impidiendo la transcripción del gen phlF que codifica para la proteína represora PhlF. Si nos fijamos ahora, el gen de la proteína YPF (Yellow Fluorescent Protein) está bajo el control del promotor PPhlF. Como no está reprimido, entonces la proteína YPF se está expresando y la bacteria brillará con luz amarilla (salida "1"). ¿Qué ocurre si hay un estímulo o entrada (situación "1,0")? es decir ¿qué ocurre si hay IPTG? Pues que el represor LacI queda inactivado y el promotor Ptac ahora puede ser usado por la RNApolimerasa para expresar el gen PhlF (basta con que haya un promotor libre para que el gen se exprese). Como ahora hay proteína represora PhlF, ésta se une al promotor PPhlF impidiendo la expresión de la proteína YPF, con lo cual la bacteria no brillará con luz amarilla (salida "0"). Lo mismo ocurre si añadimos tetraciclina (situación "0,1"), o ambos estímulos (situación "1,1"). Esta puerta NOR ahora puede ser considerada como un "biobrick" funcional.

Lo que puede hacerse es ir conectando varias de dichas puertas lógicas e ir creando circuitos genéticos cada vez más complicados. Pero claro, hay que evitar que los diferentes componentes de los circuitos - recordemos que son DNA y proteínas - se estén estorbando entre sí ya que todos ellos están dentro de la sopa que es el citoplasma de la célula. Ese es precisamente el mayor mérito que tiene el trabajo del grupo de Voight. Que han diseñado 60 circuitos con distintos "biobricks" y que han comprobado que 45 de ellos funcionan de la manera esperada. Y los "biobricks" que forman dichos circuitos funcionales han sido almacenados en una librería que es la que usa Cello para diseñar los circuitos genéticos que nosotros introduzcamos.

Cómo usar Cello. El primer paso consiste en realizar el programa con la "tabla de verdad" del circuito lógico en lenguaje Verilog. Después se añaden las condiciones previas o UCFs (genes sensores, genes actuadores, cepa de E. coli). El entorno Cello construye dicho circuito y a su vez lo transforma en una secuencia de genes utilizando para ello los "biobricks" que tiene en su librería. El programa te realiza una predicción de los resultados esperados indicando en que condiciones las células emitirán fluorescencia o no (gráficas de la derecha, líneas azules y rojas).Ahora solo queda construir el plásmido que lleva ese circuito e introducirlo en una cepa de E. coli que ya lleva los genes sensores y el gen actuador. El siguiente paso sería comprobar que efectivamente eso es lo que sucede al poner a dicha cepa de E. coli en las condiciones especificadas y ver si emite fluorescencia o no (gráficas de la derecha, curvas sólidas negras). Imagen realizada a partir de las figuras en el artículo de Voight et al.


Este trabajo permite simplificar el desarrollo de una manipulación de las redes genéticas basada en módulos. Es un gran avance, pero hay más cosas a tener en cuenta. Hace poco Victor de Lorenzo comentó en Twitter que uno de los cuellos de botella de la Biología Sintética es la implementación in vivo de este tipo de circuitos complejos es la mutación y la evolución. Recordemos que lo que estamos haciendo es manipular a un ser vivo para que haga algo que nosotros queremos, no para que ese ser vivo haga algo que le permita sobrevivir y reproducirse. Un circuito integrado de una placa base no muta o evoluciona. Siempre va a ser un semiconductor en una placa de plástico. En un ser vivo, la mutación y la evolución pueden alterar esos circuitos genéticos, sobre todo cuanto más complejos sean, de forma tal que al final la evolución nos va a derrotar y vamos a perder esa información que hemos introducido. Quizás una forma de evitar el problema sea usar "sistemas libres de células". Otra posible solución sea que algún ingeniero bioquímico diseñe una DNA-polimerasa hipermejorada que tenga una tasa de error inferior a la de 1 error por cada 10.000 nucleótidos (o mejorar todo el sistema enzimático dedicado a evitar los errores de copia) y usar esa hiiperDNApol en un chasis celular diseñado exclusivamente para alojar ese tipo de enzima. Lo cierto es que esto es una paradoja biotecnológica. La mutación y la evolución pueden ser el mejor amigo de la biotecnología ya que permite el desarrollo de nuevos caracteres o habilidades biológicas (ver simplemente el premio Nobel de Química de este año). Pero también es el peor enemigo de la biotecnología porque causa la pérdida de esas habilidades. Ya veremos que nos depara el futuro.

(*)Hay una serie de vídeos realizados por el EMBL sobre Biología Sintética en los que se pueden explorar los diversos campos en los que esta disciplina está involucrada

Plantillas para módulos de Cello.

Como he dicho más arriba, aquí dejo unas plantillas para diseñar módulos que puedan ser usados el entorno Cello. Basta sustituir el valor de los "0" por los valores de la tabla de verdad que deseamos para nuestro circuito (en la puerta NOR sería 1,0,0,0), copiar el programa y pegarlo en la ventana de Cello. También puede cambiarse la "A" por el nombre del módulo con el que queramos bautizar al programa (por ejemplo module NOR). He puesto dos plantillas .

Plantilla: 2 entradas, 1 salida

module A(output out1, input in1, in2);
always@(in1, in2)
begin
case({in1,in2})
2'b00: {out} = 1'b0;
2'b01: {out} = 1'b0;
2'b10: {out} = 1'b0;
2'b11: {out} = 1'b0;
endcase
end
endmodule


Plantilla: 3 entradas, 1 salida

module A(output out1, input in1, in2, in3);
always@(in1,in2,in3)
begin
case({in1,in2,in3})
3'b000: {out1} = 1'b0;
3'b001: {out1} = 1'b0;
3'b010: {out1} = 1'b0;
3'b011: {out1} = 1'b0;
3'b100: {out1} = 1'b0;
3'b101: {out1} = 1'b0;
3'b110: {out1} = 1'b0;
3'b111: {out1} = 1'b0;
endcase
end
endmodule

jueves, 31 de enero de 2019

¿Cómo eliminar a un enemigo interior?



La bacteria Salmonella enterica es un parásito intracelular. Eso quiere decir que penetra en la célula hospedadora, queda dentro de una vacuola y allí cumple todo su ciclo biológico alimentándose del hospedador hasta matarlo. Un "alien" microscópico en toda regla. Ser un parásito intracelular tiene una serie de ventajas, entre ellas que es más fácil escapar a la detección del sistema inmune y también que es muy difícil que los antibióticos lleguen hasta donde está la bacteria alojada. Pero también tiene un coste para la bacteria. Necesita una serie de genes que le permitan sobrevivir en el interior del hospedador. Si esos genes no funcionan, entonces el parásito no puede mantenerse dentro de la célula

Generalmente, cuando uno busca un nuevo antibiótico suele realizar un cribado (screening) en el que selecciona moléculas que interfieren con procesos o estructuras vitales de la bacteria. Por ejemplo, las penicilinas inhiben la síntesis de la pared celular destruyéndola, la estreptomicina inhibe la traducción de proteínas, las quinolona impiden la replicación del ADN, etc. Pero ahora hay una nueva estrategia, en lugar de buscar objetivos esenciales (essential targets) que maten a las bacterias, lo que se busca es inhibir objetivos secundarios, procesos o estructuras que no sean vitales para la bacteria pero sí que lo sean para su virulencia. Es decir, esos nuevos antibióticos lo que harían sería desarmar al patógeno por lo que no podría producir enfermedad y nuestro sistema inmune podría encargarse de él con mayor facilidad.

Esto es precisamente lo que se describe en un reciente artículo publicado en Nature communications. Han buscado compuestos que inhibían el crecimiento de S. enterica pero en el medio ambiente intracelular. Para ello han simulado unas condiciones similares a las de la vacuola en la que habita cuando infecta una célula hospedadora: pH ácido y con pocos iones disponibles; y al que han denominado medio LPM. En paralelo, también utilizaron un modelo de infección intracelular en macrófagos. A continuación lo que hicieron fue realizar una búsqueda de cuáles eran los genes que le permitían sobrevivir a esa bacteria en esas condiciones tan especiales. Así identificaron una serie de genes involucrados en determinadas rutas metabólicas y en la biosíntesis de las envolturas celulares. Una vez hecho esto comenzaron a buscar qué tipo de compuestos podrían afectar a las funciones codificada por dichos genes utilizando tanto el modelo de infección intracelular en macrófagos como el medio que emulaba el interior celular. De esa manera han identificado a la metergolina, una molécula que distorsiona a la membrana citoplasmática de la bacteria y que le impide sobrevivir en condiciones intracelulares.


Diagrama de flujo del cribado realizado para identificar sustancias antimicrobianas que afectasen al crecimiento intracelular de S. enterica en macrófagos y en un medio de cultivo que emulase dichas condiciones (LPM). Comenzaron analizando 1600 compuestos (cuadrados de colores de la izquierda) y en cada paso fueron refinando su búsqueda hasta quedarse con los compuestos más efectivos. Ver detalles en el texto. Fuente de la imagen: Ellis et al. 2019.



El cribado de compuestos se realizó de la siguiente manera. La primera etapa fue identificar entre una colección de 1600 compuestos cuáles interferían bien con la infección en macrófagos o bien con el crecimiento en el medio LPM. De esa manera encontraron 130 compuestos, 47 de los cuales funcionaban en ambos sistemas. A continuación determinaron cual era la potencia antimicrobiana de cada uno de esos compuestos y se quedaron con los ochenta mejores, aunque posteriormente descartaron cinco que tenían una concentración mínima inhibitoria (MIC) superior a 6,25 microMolar. Con los setenta y cinco compuesto que quedaban realizaron pruebas de citotoxicidad en macrófagos midiendo la cantidad de lactado deshidrogenasas (LDH) que era liberada al ser expuestas las células a dichos compuestos. Eso redujo el número de compuestos a cincuenta y tres. Tras reconsiderar los límites de las concentraciones mínimas inhibitorias concentraron sus esfuerzos en los quince compuestos más prometedores.

Comparación de los quince compuestos obtenidos en el cribado frente a la ciprofloxacina (localizada en el extremo derecho). Se midió la efectividad de inhibición del crecimiento intracelular de la bacteria dentro de macrófagos usando tres concentraciones distintas de cada compuesto. La metergolina es el tercer compuesto empezando por la izquierda. Fuente de la imagen: Ellis et al. 2019.


Esos quince compuestos fueron comparados con la acción antimicrobiana de la ciprofloxacina, el antibiótico de referencia en el tratamiento de las infecciones de S. enterica. De todos ellos, el que mejor comportamiento mostraba era la metergolina, un compuesto que se conoce como un psicoactivo perteneciente al grupo de los compuestos del ergot y del que no se sospechaba que pudiera tener actividad antimicrobiana. A continuación comenzaron a investigar su posible mecanismo de acción y encontraron que la metergolina lisaba afectaba a la integridad de la membrana citoplasmática. En determinadas concentraciones se alteraba el potencial de membrana, lo que afecta al estado bioenergético del a célula. Llegaron a medir que los niveles de ATP celular disminuína hasta diez veces después de la adición de metergolina al medio. En concentraciones más elevadas las células llegaban a lisar. Lo último que les quedaba comprobar era el potencial como antibiótico in vivo y para ello realizaron pruebas con ratones infectados con S. enterica comprobando que la administración de metergolina disminuía el número de bacterias presentes en los diferentes órganos y aumentaba la supervivencia de los ratones.


Metergolina. Fuente Wikipedia.


¿Qué viene ahora? Pues realizar unas cuantas pruebas más en modelos animales no solo con la metergolina, sino con derivados de la misma, y si se confirman los resultados realizar un ensayo clínico en humanos y así quizás dispongamos de un nuevo antibiótico en el futuro.

viernes, 28 de septiembre de 2018

#EUROmicroMOOC: Trends in Microbiology by Twitter


Science in Twitter: 
the first worldwide online open access microbiology course via Twitter



University of Oxford, the Institute Pasteur in Paris, Stanford University, CSIC (Spanish National Research Council), are some of the eighteen international universities and research centres which will collaborate in the first worldwide open access Microbiology course online via Twitter. A total of twenty-one professors and researchers will use this social network as a tool for teaching and communicate scientific knowledge. With a frequency of three classes per week, each lesson will address a different topic. For instance, Marta Cortesao, from the German Aerospace Center-DLR will talk about space microbiology, or Jorge García-Lara, from University of Central Lancashire (UK) about the microbial path to cancer. Vaccines and antivax, antimicrobial resistance, gut microbiota, pathogens or microbiological warfare are also some of the topics that will be discussed during the course.



Using simple and concise language, the objective is communicate science to a general audience outside the academic environments using a social network as Twitter. Lectures will consist in 30-40 tweet-size statements with associated links, related web pages, blogs, news and specially images and videos.

The course will take place over seven weeks (from October 2 to November 15) with classes scheduled every Tuesday, Wednesday and Thursday at 17:00 (UCT/GMT +2). Tweets will be sent from the@SEMicrobiologia Twitter account and will be programmed to be posted at a frequency of one tweet per minute. It is not necessary a previous registration to the course. Students can easily follow this massive online open course through their mobile devices or computer either alive at the scheduled time or later, always searching the hashtag#EUROmicroMOOC. The same hashtag will be used by the students to interact with the lecturers. All the classes will be in English and they will be compiled and stored online using the open tool Wakelet.



This initiative is organized and coordinated by the group of Teaching and Dissemination of Microbiology of the Spanish Society for Microbiology(SEM) with the collaboration of the Federation of European Microbiology Societies (FEMS).

 10 reasons why you can´t miss #EUROmicroMOOC

1.     It is the first worldwide massive online open access course via Twitter about Science and Microbiology.

2.     An international course with the participation of twenty-one professors and researchers from nine different countries.

3.     With the collaboration of eighteen universities and research centres, as the Institute Pasteur, the Spanish National Research Council, or the Universities of Oxford, Stanford, Salamanca, Navarra, …

4.     It is organized and coordinated by the group of Teaching and Dissemination of Microbiology of the Spanish Society for Microbiology (SEM), with the collaboration of the Federation of European Microbiology Societies (FEMS).

5.     It is online and open access: you can easily follow it through your mobile device or computer. You only need a Twitter account.

6.     Its purpose is to communicate Science and Microbiology to a general audience outside the academic environments using social networks.

7.     Twenty-one fascinating topics from space microbiology, microbes and cancer, vaccines, antimicrobial resistance, gut microbiota, to microbiological warfare, and much more.

8.     Entertaining but scientifically rigorous: only 30-40 minutes each day, three days per week during seven weeks.

9.     You can do it from the sofa of you home: each day at 17:00 h (UCT/GMT +2).

10. Only follow the hashtag #EUROmicroMOOC by Twitter, enjoy and learn science.

Para saber más (en castellano):



#EUROmicroMOOC (Investigación y Ciencia)

miércoles, 31 de enero de 2018

Inexpugnabilidad bacteriana

Cara del Moro en el castillo de Santa Bárbara en Alicante (Fuente: Ayto. Alicante)


Aprovechando que es el décimo aniversario del blog traigo aquí un resumen del artículo publicado en Science sobre los 10 nuevos sistemas de defensa descubiertos en los procariotas (bacterias y arqueas). A día de hoy los sistemas de defensa de los procariotas frente a los virus más famosos son dos: las enzimas de restricción y el sistema CRISPR. Ambos se basan en reconocer al DNA foráneo, ya sea vírico o plasmídico, y destruirlo o inactivarlo. Pero ahora el grupo liderado por Rotem Sorek, del instituto Weizmann en Israel han encontrado que hay muchísimos más. Haciendo una analogía, si uno se encuentra uno escudo en una habitación quizás es que eso sea la armería, así que quizás lo que haya alrededor de ese escudo también sean armas de defensa. Lo que han hecho ha sido analizar unos 45.000 genomas de bacterias y arqueas buscando agrupamientos de genes (clusters) que estuvieran localizados cerca de las conocidas como "islas defensivas", otros agrupamientos de genes cuya función en la defensa contra virus es conocida (ver figura). Así encontraron una serie de genes que parecían estar involucrados en la inmunidad bacteriana. Encontraron 28 sistemas candidatos.

Análisis computacional empleado para encontrar las familias de proteínas cercanas a las "islas defensivas". En naranja están representados los genes que codifican para proteínas conocidas que sí están involucradas en sistemas de defensa (por ejemplo la proteína Cas). En colores rosáceos se representan las proteínas que pueden tener una función defensiva y que por análisis de secuencia muestran una gran conservación. De esa forma se podían identificar los componentes de los posibles sistemas de defensa (system candidate). Fuente: Doron et al.


El siguiente paso fue verificar que efectivamente eran sistemas de defensa y para hacer eso cogieron esos genes y los introducieron en bacterias modelo: Escherichia coli cepa MG1655 y Bacillus subtilis cepa BEST7003. Finalmente, sometieron a sus microorganismos modelo al ataque de diferentes fagos. Como control positivo utilizaron diversos sistemas de modificación restricción conocidos. De los 28 sistemas candidatos han confirmado el funcionamiento de 10, uno contra plásmidos y nueve contra fagos (ver siguiente figura).

Verificación del funcionamiento de los sistemas de defensa. En A se representa el diagrama de flujo de la estrategia experimental explicada en el texto. La tabla B muestra los sistemas de defensa activos cuando son clonados en B. subtilis y la tabla C en E. coli. Para medir el grado de protección se utilizó un ensayo de dilución seriada, comparando cepas con los sistemas clonados frente a cepas que no tenían ningún sistema de defensa. Cuanto más intenso es el color, más eficiente es ese sistema frente a ese fago. El nombre con el que se ha bautizado a cada uno de los sistemas caracterizado aparece a la izquierda. A la derecha se representa la organización genética de dichos sistemas con aquellos dominios que han sido identificados. Las siglas DUF significa que es un dominio de función desconocida (domain of unknown function). Los dibujos están a escala y la barra representa 400 aminoácidos. Fuente: Doron et al. .


El nombre que han puesto a cada uno de los sistemas es el correspondiente a dioses protectores de diversas mitologías: Thoeris es la deidad egipcia de la fertilidad y protectora de los recién nacidos, Septu es el dios de los cielos en la religión antigua egipcia, Druantia es la madre eterna en la mitología gala, Kiwa es la guardiana del océano en la tradición maorí, Hachiman es el dios japonés de los guerreros, Lamassu y Shedu son deidades protectoras asirias, Gabija es el fuego protector de la familia en Lituania y Zorya es el nombre de las dos guardianas protectoras de la mitología eslava.

Aunque no describen el mecanismo preciso sobre como deben de funcionar estos sistemas, en el trabajo se especula también sobre su funcionamiento en base a las homologías encontradas. Por ejemplo, Thoeris es un sistema que se ha encontrado en 2.070 genomas de los 45.000 estudiados. El sistema es bastante específico en la defensa frente a myofagos y contiene un dominio Receptor Toll-interleuquina (TIR) que podría mediar en interacciones intracelulares. Un aspecto llamativo es que los dominios TIR están involucrados en el sistema inmune innato de muchos eucariotas y su función es el reconocimiento de estructuras asociadas a patógenos (PAMP). Como dicen los propios investigadores en el artículo sus resultados indican que hay una participación común de los dominios TIR en la inmunidad innata de los tres dominios de vida, lo que implica que el ancestro de este componente tan importante del sistema inmunitario en los ecuariotas podría haber surgido del sistema de defensa procariota frente a los fagos. Pero eso no es todo, en la revista The Scientist apuntan que, tras la experiencia previa con CRISPR y una vez dilucidados el funcionamiento de dichos sistemas, el potencial para ser transformados en herramientas biotecnológicas de nueva generación será enorme.

jueves, 14 de diciembre de 2017

Siete bioprocesos microbianos para ayudar al planeta

Planeta Microbiano (origen de la imagen)


El título de esta entrada es la traducción del que aparece en el reciente artículo que ha publicado el investigador Victor de Lorenzo. En dicho escrito el autor hace una presentación de los siete bioprocesos microbianos que requerirán un desarrollo biotecnológico en los próximos años para poder ser usados en la resolución de los problemas medioambientales a los que nos enfrentamos. Además propone que para esos bioprocesos sean efectivos a escala global deberían estudiarse mecanismos para su diseminación entre los diferentes ecosistemas. Como no hay mal que por bien no venga, para dicha diseminación global podría ser muy útil tomar como modelo la forma en la que se diseminan los genes de resistencia a los antibióticos. También se propone que se usen fagos modificados para transmitir dichas capacidades. Supongo que eso no quita para que a su vez se desarrolle un "mecanismo de seguridad" que permita remover dichas capacidades metabólicas una vez se ha resuelto el problema medioambiental, aunque eso no se comenta en el artículo.

Aquí tenemos los siete bioprocesos y el problema que podrían resolver.

1.- Rutas metabólicas no-fotosintéticas de captura del CO2. Permitiría reducir los niveles de CO2 atmosférico y de otros gases de efecto invernadero. En este artículo tenemos un ejemplo.



2.- Expresión de proteínas "capturadoras" de agua en bacterias del suelo resistentes a la desecación. De esa forma se permitiría incrementar la humedad en los ecosistemas áridos y se lucharía contra la desertificación. La actinobacteria Rhodococcus jostii RHA1 podría ser un ejemplo.



3.- Rutas metabólicas para la mineralización completa de los plásticos / Expresión de adhesinas que permitan la floculación de los plasticos. Permitiría lidiar con el creciente problema de acumulación de plásticos en los ecosistemas marinos. En la primera categoría tendríamos a Ideonella sakaniensis y su capacidad de degradar PET. En la segunda categoría, la acción de los microorganismos permitiría la inertización de los plásticos evitando la liberación de CO2 al ser biodegradados.



4.- Rutas metabólicas para la biodegradación completa de fármacos e interruptores endocrinos. Estas capacidades metabólicas permitirían eliminar a esas moléculas de las cadenas tróficas. Hay algunas ejemplos en los que se han usado hongos en biorreactores para eliminar interruptores endocrinos (endocrine disruptors) de las aguas residuales, así que un avance sería transferir esas capacidades metabólicas a bacterias que fueran mucho más eficientes.



5.- Rutas de fijación de nitrógeno insensibles al oxígeno / Expresión de enzimas fijadoras del nitrógeno en plantas. Esto permitiría un mayor rendimiento agrícola, pero sobre todo permitiría que disminuyera el uso del proceso Haber-Bosch, por lo que las actividades agrícolas serían más sostenibles (indirectamente se disminuiría las emisiones de CO2 ya que para el proceso Haber se necesita usar gas natural para producir la energía necesaria). Quizás esta sea una de las áreas donde mayor cantidad de trabajo se ha realizado.



6.- Diseño de micoorganismos hiperacumuladores de fosfato. Después del nitrógeno, el fosfato es el segundo factor limitante en los procesos agrícolas. Casi todo el fosfato se extrae de minas y éste suele acabar al final en los mares o en los sedimentos. Estos microorganismos permitirían recuperar los fosfatos tanto de los ecosistemas marinos como de los sedimentos.



7.- Diseñar microorganismos despolimerizadores de lignina / Microorganismos inertizadores de lignina. Con la lignina tenemos un problema parecido al de los plásticos. Nos puede interesar el diseño de microorganismos capaces de descomponer el polímero de lignina en sus monómeros para que luego puedan ser usados en otros procesos biotecnológicos, o nos puede interesar volver a la lignina en algo completamente recalcitrante y que no contamine.



Como puede verse, los biotecnólogos ambientales van a tener un montón de trabajo


martes, 28 de noviembre de 2017

¿Podrías acabar con un alien utilizando CRISPR?



Sin duda, Alien es el endoparásito más famoso. Una vez que el facehugger ha cumplido su trabajo no hay manera de sacar al embrión del hospedador. Éste se desarrollará y finalmente encontrará su camino hacia fuera.

Hay ciertas bacterias patógenas que se comportan como auténticos "aliens" ya que son parásitos intracelulares. Se introducen en las células y una vez allí se multiplican hasta que acaban con ellas. Los patógenos intracelulares suponen un problema cuando hay que tratar las infecciones que provocan, ya que es difícil para los antibióticos alcanzar el interior de nuestras células. Este problema se hace mucho mayor si esas bacterias parásitas son además resistentes a los antibióticos. ¿Cómo podemos deshacernos de ellas?

En un reciente artículo del Trends in Biotechnology, Adrienne C. Greene propone que se pueda utilizar la tecnología CRISPR para desarrollar un nuevo tipo de sustancias antimicrobianas que se podrían adaptar al patógeno que deben eliminar, aunque éste haya desarrollado una resistencia antimicrobiana, y que además fueran totalmente específicos evitando así dañar a la microbiota comensal. Todo muy bonito pero hay un pequeño problema. ¿Cómo hacer llegar un complejo macromolecular de RNA y proteína con un tamaño de unos 160 kD hasta el interior de una bacteria objetivo? Un abordaje que se ha intentado con éxito es el siguiente. En primer lugar diseñar un complejo CRISPR/RNA capaz de eliminar un gen esencia de un patógeno. Después codificar ese complejo CRISPR/RNA en un fásmido. De esa forma el complejo queda encapsulado en una cápsida de fago que luego es usado para infectar a la bacteria objetivo. Una vez dentro, el complejo CRISPR/RNA se encarga de destruir genes esenciales y acabar con el patógeno.

Ahora esta idea se quiere llevar un paso más allá combiando los fásmidos CRISPR y la nanotecnología para eliminar patógenos intracelulares. El problema a solventar es cómo dirigir a esos fásmidos hasta las células objetivo y hacerlos entrar para que acaben con la bacteria. En la figura de abajo se muestra la idea. En A tenemos el fásmido que codifica para el complejo CRISPR/RNA y que es específico de la bacteria patógena. En B, los fásmidos son encapsulados en partículas de sílice. Dichas partículas serían funcionalizadas con una membrana (C) en la que se dispondrían péptidos y proteínas diseñadas para unirse a las células infectadas (D). Una vez dentro de la célula los fagos serían liberados y se unirían a las bacterias patógenas (E) introduciéndoles el complejo CRISPR y matándolas (F) sin afectar a la célula hospedadora.



La idea tiene muchas ventajas. Los fagos son muy específicos por lo que no afectarían a la microbiota normal. Además, se podrían diseñar las partículas para que solo reconocieran a las células infectadas y no a otras. Pero también es verdad que hay un poco de "cuento de la lechera". La nanotecnología necesaria para elaborar esas partículas funcionalizadas donde irán encapsulados los fagos todavía no existe. El problema es que los fagos son muy variables en morfología y un diseño de cápsula que permita la utilización para un fago no tiene porque valer para otro. Otro problema es encontrar el fago que sea capaz de unirse al patógeno que queremos eliminar. Para ello se necesitan avances en las tecnologías de cribado (screening) de fagos que permitan encontrar una aguja en un pajar de forma rápida, sencilla y barata.

Como dice el autor del artículo, la pregunta que queda al final es cómo adaptar una idea que funciona en el laboratorio al tratamiento de las futuras amenazas infecciosas. Y quien sabe, quizás diseñar en el futuro un fásmido anti-alien.

martes, 21 de noviembre de 2017

El retorno de las hormigas-zombi

Hormigas-zombi


Ya hemos hablado en este blog del hongo parásito Ophiocordyceps unilateralis también conocido como el hongo que convierte a las hormigas en zombis. Recientemente se ha publicado un trabajo en la revista PNAS que ha permitido una mejor comprensión de cómo hace el hongo para manipular el comportamiento de su hospedador.

Maridel Fredericksen, una estudiante del grupo liderado por David Hughes ha estudiado las interacciones a nivel celular entre el hongo y las células de los tejidos de la hormiga. Para ello lo que han hecho es coger hormigas y parasitarlas, o bien con O. unilateralis o con el hongo Beauveria bassiana. Este último es un hongo entomófago que invade todos los tejidos del insecto pero que no modifica su comportamiento (y que tiene interesantes aplicaciones biotecnológicas como bioinsecticida). Después han cogido las hormigas parasitadas y las han cortado en rebanadas con un grosor de 50 nanómetros. Luego han hecho fotografías microscopicas de cada una de esas rebanadas y posteriormente han reconstruido en 3D lo que han observado. ¿Parece fácil? No lo es tanto. Para hacer la reconstrucción 3D se tenían que manejar unas 2000 imágenes en las cuales hay que distinguir entre las células del hongo y las células de la hormiga. Asumiendo que una persona entrenada puede hacer dicho trabajo en 20 minutos (es mucho asumir) eso quiere decir que necesitaríamos todas las horas de un mes completo para completar el análisis. En lugar de eso lo que han hecho es colaborar con un grupo de Inteligencia Artificial para poder enseñar a un ordenador (lo que se denominan procesos "deep-learning") a distinguir entre las células fúngicas y del insecto para que posteriormente realizara la reconstrucción.


Reconstrucción tridimensional de la red fúngica que rodea las fibras musculares del insecto. En A se representa una fibra del músculo abductor de la mandíbula (en rojo) rodeado por 25 cuerpos hifales (amarillo). Clickear en la imagen para verla más grande. Las conexiones entre las células del hongo son pequeños tubos. Varias de las células tienen hifas en los polos y algunas corren paralelas a la fibra muscular (cabeza de flecha en recuadro interior). En el vídeo puede verse como se ha realizado esta reconstrucción. En B se muestran dos proyecciones diferentes de la reconstrucción. Las fibras musculares se encuentran en azul y los cuerpos fúngicos en rojo. Fuente de la imagen: Fredericksen et al. 2017.


Una vez realizadas las reconstrucciones lo que han visto es que en el caso de B. bassiana las hifas invaden todos los tejidos del insecto indistintamente. Pero en el caso de O. unilateralis lo que se han encontrado es que el micelio del hongo crece por todo el interior del insecto formando una red interconectada por unas estructuras especializadas a las que han denominado CATs por conidial anastomosis tubes. Las hifas rodean las fibras musculares de la hormiga pero sin destruirlas (puede verse la reconstrucción en este vídeo). También han visto que el hongo destruye las neuronas motoras de la hormiga asegurándose así el control muscular. Finalmente, han visto que el hongo no invade el cerebro de la hormiga. Lo que hace el hongo es controlar al hospedador de manera periférica al parecer secretando una serie de sustancias. Según Hughes, la hormiga se convierte en una marioneta en el que las cuerdas serían las hifas del hongo. Los investigadores creen que el hongo no ataca el cerebro de la hormiga hasta que se ésta no realiza el mordisco final en el envés de la hoja donde quedará fijada.