Garrapatas, cerdos y trasplantes

¿Ha tenido alguna vez una avería en su coche en la que le hayan tenido que cambiar una pieza del motor? Aparte del gasto monetario, la otra preocupación que uno puede tener es que no le hayan puesto un recambio de segunda mano. Normalmente los talleres ponen piezas originales y el coche vuelve a funcionar una vez más. A veces se comparan los trasplantes de órganos con llevarnos al taller para que nos recambien la pieza defectuosa. Sin embargo, a diferencia del ejemplo mecánico, en los seres humanos sí que se utilizan «piezas de segunda mano», ya que se requiere un donante de órganos para el trasplante.

 

Entrada publicada en la revista Ars Creatio. Para continuar leyendo haz click aquí.

¿Cuándo nació la biotecnología moderna?

Biotecnología clásica (arriba) y Biotecnología moderna (abajo). Imagen elaborada a partir de imágenes de la Wikipedia (agricultura en el Antiguo Egipto y elaboración de la cerveza) y de EducaMadrid (los diferentes tipos de biotecnología)  

La biotecnología podría definirse como el uso y mejora de los seres vivos por su interés económico y/o industrial. Atendiendo a esa definición, los seres humanos comenzamos a practicar la biotecnología desde el primer momento en que comenzamos a domesticar a un animal o a una planta para nuestro beneficio, hace ya unos cuantos milenios. Sin embargo, a cualquier persona de la calle, el término «biotecnología» probablemente le sonará más a manipulación genética de los seres vivos con el objetivo de producir nuevos medicamentos, alimentos o materiales. Por eso, en los libros y artículos especializados se suele hacer la distinción entre «biotecnología clásica», en la cual se manipula a los seres vivos mediante el cruce y la selección, y la «biotecnología moderna», en la cual la manipulación es por ingeniería genética.

Publicado en la resvista Ars Creatio. Para seguir leyendo cliquea aquí.

¿Comeremos metano en el futuro?

Si es un fan de la Ciencia-Ficción seguro que conoce la película "Soylent Green" (aquí se tituló "Cuando el destino nos alcance"). Si no lo es, le recomiendo que la vea si tiene ocasión. En el año 2022 el mundo estará superpoblado y nos alimentaremos a base de unas galletitas nutritivas que producirá la compañía "Soylent". Esas galletitas están hechas a base de microorganismos y sazonadas con un ingrediente especial.

La película está inspirada en una novela escrita en 1966 en la que se describe ese mundo superpoblado. Cuando la MGM compró los derechos le dio carta blanca al guionista Stanley R. Greenberg para crear una distopía completamente distinta y mucho más desasosegante. En los años 70 del pasado siglo una de los temas recurrentes era la respuesta a la pregunta ¿Cómo vamos a alimentar a tanta gente? Y una de las respuestas era la producción de proteína unicelular o SCP (por Single Cell Protein). O en otras palabras: comer microbios. La idea no es tan extraña como puede parecer a primera vista. De hecho, ya comemos microbios cuando nos tomamos un yogur. La pequeña diferencia reside en que en lugar de usar leche para crecer microbios, lo que se pensaba usar era petróleo o alguno de sus productos derivados.

La británica ICI (Imperial Chemical Industries) fue la primera compañía en poner en práctica dicha idea. El microorganismos utilizado fue la bacteria Methylophilus methylotropha, y la fuente de carbono sería el metanol producido como subproducto en las refinerías de pteróleo. Se diseñó el fermentador más grande del mundo para la producción a gran escala. Era un fermentador de vaina hundida con un volumen de trabajo de 1.000 m³ (1.000.000 de litros). El producto fue bautizado como Pruteen y tenía una composición nutricional muy buena (más de un 70% del peso seco era proteína). Sin embargo, cuando se consiguió establecer la producción en el año 1980, no pudo competir económicamente con la soja. La tonelada de Pruteen costaba 600 dólares, mientras que la soja costaba como máximo 190 dólares. Así que la fábrica quebró y fue demolida en 1988.

Pero la idea de la SCP no ha muerto, solo se ha transformado. Hay un par de compañías que han puesto a punto plantas piloto para producir SCP a partir de metano, otro subproducto de la producción del petróleo. Cada año se queman 140.000 millones de metros cúbicos de metano en esas instalaciones (un 30% del consumo de gas natural de la Unión Europea). Así que la idea es utilizar ese metano para dar de comer a la bacteria metanotrofa Methylococcus capsulatus. Luego lo que hay que hacer es procesar a la bacteria y convertirla en pienso para el ganado o para peces. Como he apuntado antes hay dos compañías que están desarrollando la idea. Una es la norteamericana Calysta, y la otra la compañía danesa Unibio. Esta última parece que ha conseguido financiación para pasar de planta piloto a planta industrial. La primera factoría parece que se va a establecer en Rusia, pero tienen planes de poner otra en los Estados Unidos.

La compañía Unibio utiliza un fermentador en bucle impulsado por inyección de gas conocido en inglés como U-loop Fermenter (parece que Calysta también usa un biorreactor parecido, pero en su web no dan detalles de ello). El U-loop Fermentor tiene un diseño ingenieril peculiar (ver la figura de abajo). El fermentador está enterrado, pues de esa forma las paredes pueden aguantar la presión interna debida a la inyección de gas natural y de oxígeno. En el fermentador además hay que inyectar sales minerales y una fuente de nitrógeno (puede ser amonio gaseoso) (5). Es un cultivo en crecimiento continuo que debe mantenerse a 45ºC de temperatura gracias a un intercambiador de calor (7). En un cultivo continuo está entrando un flujo constante de nutrientes (5) y por otro lado se está retirando el mismo volumen de cultivo con biomasa bacteriana (2). La parte superior del fermentador es un depósito de gran volumen que está parcialmente lleno para actuar como cámara de desgasificación (1) que permite que el CO2 producido pueda ser liberado (3). En esa cámara está también la salida del medio conteniendo microorganismos (2). La impulsión del fluido no solo es por la inyección del gas, también tiene incorporado una bomba que impulsa el fluido hacia la cámara de desgasificación (el punto 4 es el motor y el punto 6 es la turbina de impulsión). Adicionalmente, tiene una serie de deflectores internos en espiral que permiten la correcta mezcla de las fases gaseosas, los nutrientes adicionales y las bacterias (8). El tamaño del fermentador de la planta piloto es de 50 m³ y puede llegar a producir 4 kilogramos de biomasa por metro cúbico y por hora.

Esquema del U-loop Fermenter de la compañía Unibio. La explicación del funcionamiento está en el texto

El cultivo con la biomasa bacteriana se centrifuga para concentrar las células y posteriormente se las somete a un proceso de ruptura. El extracto pasa a una unidad de secado por espray de aire caliente. De esa forma se consiguen gránulos de proteína unicelular con un contenido de un 72,9% de proteína. La compañía ha bautizado a este producto con el nombre de UniProtein.

El aspecto final del producto UniProtein. Fuente de la imagen: Unibio

Como he indicado antes, el Uniprotein es para piensos, pero quién sabe. Quizás en un futuro vendan galletitas con el nombre de Unisoylent.

Domesticando microbios

Las consecuencias de la domesticación. Origen de la imagen: Finofilipino.

Hace unos 15.000 años los humanos comenzamos a domesticar a una especie de lobo gris (Canis lupus) y la transformamos en perro (Canis familiaris). Es muy probable que hace 23.000 años comenzáramos la proto-domesticación de algunas plantas. La transformación de una especie silvestre en una especie domesticada es algo relativamente sencillo. Lo único que tienes que hacer es controlar la reproducción y escoger las características que más te interesa que se perpetúen en la especie que vayas a domesticar. Si esas características son heredables poco a poco se irán fijando en la población domesticada. Al mismo tiempo, la población silvestre irá disminuyendo. La fijación de las características heredables parece que es mucho más rápida cuando se trata de domesticar animales que en las plantas. Es probable que sea porque el "aislamiento genético" necesario para la especiación es más fácil de conseguir con un animal que con una planta. En 1958 el biólogo ruso Dmitri Beliáyev realizó el llamado "experimento de domesticación del zorro". Lo que hizo fue tomar una población de zorros (Vulpes vulpes) y seleccionó para su cría a aquellos zorros que mostraban más miedo hacia los humanos. Luego volvía repetir la selección con los descendientes. Solo dejaba reproducirse a un 10% de cada generación creando lo que se conoce como "cuello de botella" genético. En la cuarta generación los zorros ya meneaban la cola al ver a un humano. En la sexta generación ya había cachorros que gemían de alegría al ver a un humano y se acercaban a lamer las manos a la manera de un perro doméstico. A lo largo del experimento, que aún continua, 10.500 zorros han sido usados como progenitores y 50.000 cachorros han sido examinados por su carácter domesticable. Los cambios genéticos observados afectan sobre todo a la reducción de los niveles de hormonas como la adrenalina y el cortisol (Actualización. Recientemente este experimento ha sido puesto en entredicho. Más información en este enlace).

Pues bien, los humanos hicimos algo parecido con los microbios, aunque no fuéramos conscientes de ello. Hace unos 15.000 años, en una zona de Oriente Medio (ver mapa) apareció la cultura preneolítica conocida como Natufiense. Hay evidencias que muestran que dicha cultura ya elaboraba pan hace 14.400 años. Ese pan era elaborado a partir de un triturado de diversas gramíneas junto con otros vegetales. Luego ese harina se mezclaba con agua y se elaboraba una masa con la que hacían una especie de tortas que calentaban en un fuego. Desconocemos si en la elaboración de ese pan se dejaba fermentar la masa antes de ser cocida pero, 1000 años después, alguien de la misma cultura que habitaba la cueva israelí de Raqefet, ya había aprendido a germinar los granos de cereal para después tostarlos, molerlos, mezclarlos con agua y dejarlos fermentar. Es decir, alguien había comenzado a elaborar cerveza siendo la primera prueba arqueológica de la domesticación de los microbios.

La cultura Natufiense, el pan y la cerveza. El mapa de la izquierda muestra los principales asentamientos de dicha cultura (origen de la imagen, Wikipedia). En el centro se muestra el hogar donde se han encontrado restos de cocción del pan (excavación de Shubayqa, cerca de Wadi Uwainid. Origen de la imagen, Arranz-Otaegui et al.). A la derecha los morteros hechos con rocas utilizados para almacenar grano y los morteros en roca utilizados para machacar dichos granos y elaborar cerveza (excavación de la cueva de Raqefet, cerca de El Wad. Origen de la imagen, Liu et al.).  

Nuestros antepasados eran antiguos pero no tontos. Si elaboraban cerveza eso implica que conocían que el proceso de fermentación era reproducible. Así que no es difícil imaginar que si les salía una partida de cerveza con un sabor mejor que el de otra partida de cerveza, seguramente utilizarían la primera como inóculo de las siguientes fermentaciones. Pero aquí hay una diferencia con respecto a las plantas o los animales. No podían aislar a un solo microorganismo, lo que aislaban era a un conjunto de ellos. Sin embargo, consiguieron crear un "cuello de botella" ya que lo que seleccionaron eran comunidades microbianas que crecían de manera óptima en el caldo de cultivo consistente en el cereal malteado y cocido en agua. En esas condiciones los microbios que más prosperan son las levaduras, ya que son capaces de crecer en medios con altas concentraciones de azúcar, con poco oxígeno y con presencia de alcohol. Seguramente, los antiguos debieron notar que algunas cervezas les ponían más "contentos" que otras, porque la resistencia al alcohol parece que es uno de los caracteres que fue seleccionado durante este proceso de domesticación.

En el año 2016 el grupo de Kevin J. Verstrepen realizó el primer análisis filogenético de cepas domesticadas de Saccharomyces cerevisiae. Su análisis se vio complementado en el año 2018 por el grupo de Feng Yan Bai, que analizó 106 cepas silvestres y 166 cepas industriales. En ese análisis concluyó que el ancestro común de todas las cepas de S. cerevisiae proviene del Lejano Oriente. En una reciente revisión aparece publicado un árbol filogenético con todas las cepas analizadas hasta el momento. Lo que muestra es que hay dos ramas con levaduras domesticadas: la rama asiática con levaduras especializadas en fermentaciones sobre sustrato sólido, y la rama europea, con levaduras especializadas en las fermentaciones líquidas. Aún no se sabe si las levaduras fueron primero domesticadas en Asia y desde allí se extendieron al resto del mundo, o si por el contrario la domesticación fue realizada de manera independiente en Europa y Asia. ¿Por qué no se sabe? Pues porque precisamente faltan por analizar muestras de cepas de levaduras industriales originarias de zonas del Oriente Medio (no sé si algún grupo lo está llevando a cabo o si esa falta se debe a que no existen. Recordemos que en el Islam las bebidas fermentadas están prohibidas).

Árbol filogenético de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La rama verde de la derecha son las cepas silvestres. La rama naranja son las cepas industriales asiáticas, que son usadas sobre todo para hacer pan. La rama roja son los aislados industriales europeos, que se utilizan principalmente en la elaboración de bebidas alcohólicas. Dentro de esa rama hay dos anomalías. El primero son las de cepas silvestres aisladas de la encina (mediterranean oak) que está relacionado con las levaduras del vino. Se piensa que su origen está en un "asilvestramiento" de las levaduras vínicas. El segundo es más extraño. Es el cluster de levaduras usadas en las fermentaciones lácticas en la zona de Mongolia. ¿Las habrá llevado de vuelta un conquistador mongol desde Europa hasta las estepas asiáticas? Confiemos en que futuros análisis despejarán ambos enigmas. Origen de la imagen: Steensels et al. 2019

En esa misma revisión se habla de los diversos procesos biológicos implicados en la domesticación de los microorganismos usados en la industria. Hay cambios genéticos como la pérdida de genes o la decadencia del tamaño del genoma. También se han encontrado hibridaciones interespecíficas (recordemos aquí el origen de la levadura S.pastorianus), transferencias genéticas horizontales, aneuploidía, recombinaciones cromosómicas. Por ejemplo, las levadura vínicas tienen una alta resistencia al cobre, algo lógico si tenemos en cuenta que el sulfatado de las cepas era una práctica habitual en la viticultura. En el caso de las levadura cerveceras se ha encontrado que tienen aumentada su capacidad de metabolizar la maltotriosa y que tienen duplicados los genes MAL, una adaptación para aprovechar eficazmente los azúcares provenientes del almidón de los cereales. En los lactobacilos se ha encontrado que han perdido capacidades para biosintetizar aminoácidos pero a cambio tienen genes para lactasas y proteasas adquiridos por transferencia horizontal. Lo mismo ha ocurrido con los genes para amilasas codificados por el hongo Aspergillus oryzae, utilizado en el procesamiento del arroz para así producir sake. Confío en que gracias a las nuevas técnicas analíticas, tanto en el campo de la arqueología como en el campo de la filogenia molecular, vamos a ir rellenando más y más huecos sobre la relación histórica entre los humanos y los microbios.

Consecuencias de la domesticación de la levadura
Meme generado usando imágenes sin copyright de la Wikipedia

Recientemente, la revista "Trends in Genetics" ha escogido a Saccharomyces cerevisiae como genoma del mes.

Mi agradecimiento a Dani Torregrosa (@DaniEPAP) por sus ánimos para que retomase el blog. Espero ser más constante esta vez.

Terapia con fagos ¿a la centésima va la vencida?

Si le gusta la microbiología seguramente habrá oído hablar de la película "El doctor Arrowsmith". Dirigida en 1931 por John Ford, adapta la novela homónima escrita en 1925 por el premio Nobel Sinclair Lewis. Entre las distintas vicisitudes que le ocurren al microbiólogo protagonista está el descubrimiento de un bacteriófago que elimina las bacterias de forma rápida y eficaz, por lo que podría ser usado como una nueva terapia contra las infecciones bacterianas. Sin embargo su alegría se ve empañada cuando su mentor le informa que en Francia, el investigador Felix d’Herelle se le ha adelantado y ya ha publicado el mismo descubrimiento.

Entrada publicada en el blog Microbichitos. Para continuar leyendo clickea aquí.

Inexpugnabilidad bacteriana

Cara del Moro en el castillo de Santa Bárbara en Alicante (Fuente: Ayto. Alicante)

Aprovechando que es el décimo aniversario del blog traigo aquí un resumen del artículo publicado en Science sobre los 10 nuevos sistemas de defensa descubiertos en los procariotas (bacterias y arqueas). A día de hoy los sistemas de defensa de los procariotas frente a los virus más famosos son dos: las enzimas de restricción y el sistema CRISPR. Ambos se basan en reconocer al DNA foráneo, ya sea vírico o plasmídico, y destruirlo o inactivarlo. Pero ahora el grupo liderado por Rotem Sorek, del instituto Weizmann en Israel han encontrado que hay muchísimos más. Haciendo una analogía, si uno se encuentra uno escudo en una habitación quizás es que eso sea la armería, así que quizás lo que haya alrededor de ese escudo también sean armas de defensa. Lo que han hecho ha sido analizar unos 45.000 genomas de bacterias y arqueas buscando agrupamientos de genes (clusters) que estuvieran localizados cerca de las conocidas como "islas defensivas", otros agrupamientos de genes cuya función en la defensa contra virus es conocida (ver figura). Así encontraron una serie de genes que parecían estar involucrados en la inmunidad bacteriana. Encontraron 28 sistemas candidatos.

Análisis computacional empleado para encontrar las familias de proteínas cercanas a las "islas defensivas". En naranja están representados los genes que codifican para proteínas conocidas que sí están involucradas en sistemas de defensa (por ejemplo la proteína Cas). En colores rosáceos se representan las proteínas que pueden tener una función defensiva y que por análisis de secuencia muestran una gran conservación. De esa forma se podían identificar los componentes de los posibles sistemas de defensa (system candidate). Fuente: Doron et al.

El siguiente paso fue verificar que efectivamente eran sistemas de defensa y para hacer eso cogieron esos genes y los introducieron en bacterias modelo: Escherichia coli cepa MG1655 y Bacillus subtilis cepa BEST7003. Finalmente, sometieron a sus microorganismos modelo al ataque de diferentes fagos. Como control positivo utilizaron diversos sistemas de modificación restricción conocidos. De los 28 sistemas candidatos han confirmado el funcionamiento de 10, uno contra plásmidos y nueve contra fagos (ver siguiente figura).

Verificación del funcionamiento de los sistemas de defensa. En A se representa el diagrama de flujo de la estrategia experimental explicada en el texto. La tabla B muestra los sistemas de defensa activos cuando son clonados en B. subtilis y la tabla C en E. coli. Para medir el grado de protección se utilizó un ensayo de dilución seriada, comparando cepas con los sistemas clonados frente a cepas que no tenían ningún sistema de defensa. Cuanto más intenso es el color, más eficiente es ese sistema frente a ese fago. El nombre con el que se ha bautizado a cada uno de los sistemas caracterizado aparece a la izquierda. A la derecha se representa la organización genética de dichos sistemas con aquellos dominios que han sido identificados. Las siglas DUF significa que es un dominio de función desconocida (domain of unknown function). Los dibujos están a escala y la barra representa 400 aminoácidos. Fuente: Doron et al. .

El nombre que han puesto a cada uno de los sistemas es el correspondiente a dioses protectores de diversas mitologías: Thoeris es la deidad egipcia de la fertilidad y protectora de los recién nacidos, Septu es el dios de los cielos en la religión antigua egipcia, Druantia es la madre eterna en la mitología gala, Kiwa es la guardiana del océano en la tradición maorí, Hachiman es el dios japonés de los guerreros, Lamassu y Shedu son deidades protectoras asirias, Gabija es el fuego protector de la familia en Lituania y Zorya es el nombre de las dos guardianas protectoras de la mitología eslava.

Aunque no describen el mecanismo preciso sobre como deben de funcionar estos sistemas, en el trabajo se especula también sobre su funcionamiento en base a las homologías encontradas. Por ejemplo, Thoeris es un sistema que se ha encontrado en 2.070 genomas de los 45.000 estudiados. El sistema es bastante específico en la defensa frente a myofagos y contiene un dominio Receptor Toll-interleuquina (TIR) que podría mediar en interacciones intracelulares. Un aspecto llamativo es que los dominios TIR están involucrados en el sistema inmune innato de muchos eucariotas y su función es el reconocimiento de estructuras asociadas a patógenos (PAMP). Como dicen los propios investigadores en el artículo sus resultados indican que hay una participación común de los dominios TIR en la inmunidad innata de los tres dominios de vida, lo que implica que el ancestro de este componente tan importante del sistema inmunitario en los ecuariotas podría haber surgido del sistema de defensa procariota frente a los fagos. Pero eso no es todo, en la revista The Scientist apuntan que, tras la experiencia previa con CRISPR y una vez dilucidados el funcionamiento de dichos sistemas, el potencial para ser transformados en herramientas biotecnológicas de nueva generación será enorme.

Siete bioprocesos microbianos para ayudar al planeta

Planeta Microbiano (origen de la imagen)

El título de esta entrada es la traducción del que aparece en el reciente artículo que ha publicado el investigador Victor de Lorenzo. En dicho escrito el autor hace una presentación de los siete bioprocesos microbianos que requerirán un desarrollo biotecnológico en los próximos años para poder ser usados en la resolución de los problemas medioambientales a los que nos enfrentamos. Además propone que para esos bioprocesos sean efectivos a escala global deberían estudiarse mecanismos para su diseminación entre los diferentes ecosistemas. Como no hay mal que por bien no venga, para dicha diseminación global podría ser muy útil tomar como modelo la forma en la que se diseminan los genes de resistencia a los antibióticos. También se propone que se usen fagos modificados para transmitir dichas capacidades. Supongo que eso no quita para que a su vez se desarrolle un "mecanismo de seguridad" que permita remover dichas capacidades metabólicas una vez se ha resuelto el problema medioambiental, aunque eso no se comenta en el artículo.

Aquí tenemos los siete bioprocesos y el problema que podrían resolver.

1.- Rutas metabólicas no-fotosintéticas de captura del CO₂. Permitiría reducir los niveles de CO₂ atmosférico y de otros gases de efecto invernadero. En este artículo tenemos un ejemplo.

2.- Expresión de proteínas "capturadoras" de agua en bacterias del suelo resistentes a la desecación. De esa forma se permitiría incrementar la humedad en los ecosistemas áridos y se lucharía contra la desertificación. La actinobacteria Rhodococcus jostii RHA1 podría ser un ejemplo.

3.- Rutas metabólicas para la mineralización completa de los plásticos / Expresión de adhesinas que permitan la floculación de los plasticos. Permitiría lidiar con el creciente problema de acumulación de plásticos en los ecosistemas marinos. En la primera categoría tendríamos a Ideonella sakaniensis y su capacidad de degradar PET. En la segunda categoría, la acción de los microorganismos permitiría la inertización de los plásticos evitando la liberación de CO₂ al ser biodegradados.

4.- Rutas metabólicas para la biodegradación completa de fármacos e interruptores endocrinos. Estas capacidades metabólicas permitirían eliminar a esas moléculas de las cadenas tróficas. Hay algunas ejemplos en los que se han usado hongos en biorreactores para eliminar interruptores endocrinos (endocrine disruptors) de las aguas residuales, así que un avance sería transferir esas capacidades metabólicas a bacterias que fueran mucho más eficientes.

5.- Rutas de fijación de nitrógeno insensibles al oxígeno / Expresión de enzimas fijadoras del nitrógeno en plantas. Esto permitiría un mayor rendimiento agrícola, pero sobre todo permitiría que disminuyera el uso del proceso Haber-Bosch, por lo que las actividades agrícolas serían más sostenibles (indirectamente se disminuiría las emisiones de CO₂ ya que para el proceso Haber se necesita usar gas natural para producir la energía necesaria). Quizás esta sea una de las áreas donde mayor cantidad de trabajo se ha realizado.

6.- Diseño de micoorganismos hiperacumuladores de fosfato. Después del nitrógeno, el fosfato es el segundo factor limitante en los procesos agrícolas. Casi todo el fosfato se extrae de minas y éste suele acabar al final en los mares o en los sedimentos. Estos microorganismos permitirían recuperar los fosfatos tanto de los ecosistemas marinos como de los sedimentos.

7.- Diseñar microorganismos despolimerizadores de lignina / Microorganismos inertizadores de lignina. Con la lignina tenemos un problema parecido al de los plásticos. Nos puede interesar el diseño de microorganismos capaces de descomponer el polímero de lignina en sus monómeros para que luego puedan ser usados en otros procesos biotecnológicos, o nos puede interesar volver a la lignina en algo completamente recalcitrante y que no contamine.

Como puede verse, los biotecnólogos ambientales van a tener un montón de trabajo

¿Podrías acabar con un alien utilizando CRISPR?

Sin duda, Alien es el endoparásito más famoso. Una vez que el facehugger ha cumplido su trabajo no hay manera de sacar al embrión del hospedador. Éste se desarrollará y finalmente encontrará su camino hacia fuera.

Hay ciertas bacterias patógenas que se comportan como auténticos "aliens" ya que son parásitos intracelulares. Se introducen en las células y una vez allí se multiplican hasta que acaban con ellas. Los patógenos intracelulares suponen un problema cuando hay que tratar las infecciones que provocan, ya que es difícil para los antibióticos alcanzar el interior de nuestras células. Este problema se hace mucho mayor si esas bacterias parásitas son además resistentes a los antibióticos. ¿Cómo podemos deshacernos de ellas?

En un reciente artículo del Trends in Biotechnology, Adrienne C. Greene propone que se pueda utilizar la tecnología CRISPR para desarrollar un nuevo tipo de sustancias antimicrobianas que se podrían adaptar al patógeno que deben eliminar, aunque éste haya desarrollado una resistencia antimicrobiana, y que además fueran totalmente específicos evitando así dañar a la microbiota comensal. Todo muy bonito pero hay un pequeño problema. ¿Cómo hacer llegar un complejo macromolecular de RNA y proteína con un tamaño de unos 160 kD hasta el interior de una bacteria objetivo? Un abordaje que se ha intentado con éxito es el siguiente. En primer lugar diseñar un complejo CRISPR/RNA capaz de eliminar un gen esencia de un patógeno. Después codificar ese complejo CRISPR/RNA en un fásmido. De esa forma el complejo queda encapsulado en una cápsida de fago que luego es usado para infectar a la bacteria objetivo. Una vez dentro, el complejo CRISPR/RNA se encarga de destruir genes esenciales y acabar con el patógeno.

Ahora esta idea se quiere llevar un paso más allá combiando los fásmidos CRISPR y la nanotecnología para eliminar patógenos intracelulares. El problema a solventar es cómo dirigir a esos fásmidos hasta las células objetivo y hacerlos entrar para que acaben con la bacteria. En la figura de abajo se muestra la idea. En A tenemos el fásmido que codifica para el complejo CRISPR/RNA y que es específico de la bacteria patógena. En B, los fásmidos son encapsulados en partículas de sílice. Dichas partículas serían funcionalizadas con una membrana (C) en la que se dispondrían péptidos y proteínas diseñadas para unirse a las células infectadas (D). Una vez dentro de la célula los fagos serían liberados y se unirían a las bacterias patógenas (E) introduciéndoles el complejo CRISPR y matándolas (F) sin afectar a la célula hospedadora.

La idea tiene muchas ventajas. Los fagos son muy específicos por lo que no afectarían a la microbiota normal. Además, se podrían diseñar las partículas para que solo reconocieran a las células infectadas y no a otras. Pero también es verdad que hay un poco de "cuento de la lechera". La nanotecnología necesaria para elaborar esas partículas funcionalizadas donde irán encapsulados los fagos todavía no existe. El problema es que los fagos son muy variables en morfología y un diseño de cápsula que permita la utilización para un fago no tiene porque valer para otro. Otro problema es encontrar el fago que sea capaz de unirse al patógeno que queremos eliminar. Para ello se necesitan avances en las tecnologías de cribado (screening) de fagos que permitan encontrar una aguja en un pajar de forma rápida, sencilla y barata.

Como dice el autor del artículo, la pregunta que queda al final es cómo adaptar una idea que funciona en el laboratorio al tratamiento de las futuras amenazas infecciosas. Y quien sabe, quizás diseñar en el futuro un fásmido anti-alien.

Medicamentos, precios, avaricia y generosidad

Daraprim, el medicamento que ha despertado a los codiciosos (fuente de la imagen)

Hace unos días saltó a los medios de comunicación norteamericanos una noticia muy llamativa. La compañía Turing Pharmaceuticals había subido el precio del medicamento Daraprim de 13 a 750 dólares. Este incremento del 5769% (57,7 veces el valor inicial) sólo afecta a las ventas en los Estados Unidos. Como uno se puede imaginar la noticia, junto con las manifestaciones de enfado y cólera, corrió como la pólvora en las redes sociales. A primera vista parecía el típico caso de empresa farmacéutica dueña de un novedoso medicamento patentado para alguna enfermedad importante que trata de hacer beneficio a toda costa. Pero en cuanto leías un poco te dabas cuenta que la historia era algo mucho más compleja y sorprendente.

Lo primero que llamaba la atención es que el Daraprim no es un medicamento nuevo. El nombre técnico es pirimetamina. Se trata de un antiprotozoario desarrollado en 1953 por Gertrude Elion cuando trabajaba para los laboratorios farmacéuticos Burroughs-Wellcome (actualmente GlaxoSmithKline). La pirimetamina se utilizó para combatir la malaria, pero se demostró que también era un buen medicamento contra el patógeno de la toxoplasmosis. La patente expiró en los años 70, por lo que es un medicamento que puede hacer cualquier compañía de forma genérica (de hecho eso es lo que ocurre en casi todos los países del mundo) aunque GlaxoSmithKline sigue frabricándolo para muchos países, entre ellos España. Actualmente el Daraprim no es un medicamento muy usado en los países del 1º mundo ya que afortunadamente la malaria o la toxoplasmosis no son muy habituales, pero sí que lo es en países en vías de desarrollo y por ello la OMS lo considera como un medicamento esencial. Uno de sus usos es como profilaxis para evitar infecciones oportunistas de Toxoplasma gondii en personas que padecen el SIDA.

Gertrude Elion, no sólo descubrió la  pirimetamina (fórmula), también intervino en el desarrollo de otros fármacos como el antibiótico trimetropina, o los antivirales aciclovir y AZT. Recibió el premio Nobel de Medicina en 1988 (fuente de las imágenes Wikipedia)

Entonces, si es un medicamento que se puede hacer de forma genérica ¿por qué esa subida de precio tan exagerada? Pues digamos que aquí se ha realizado una extraña mezcla entre un éxito de la salud pública, unas leyes de regulación del mercado para proteger a los pacientes y la codicia. Como ya he dicho más arriba, el Daraprim es un medicamento que es muy eficaz contra las infecciones de Toxoplasma gondii. Afortunadamente, ese tipo de infecciones son cada vez más raras en paises desarrollados como pueden ser los Estados Unidos. Y eso se ve reflejado en el número de recetas emitidas de Daraprim: en el 2011 fueron 12.700, en el 2014 el número bajó a 8.821. Bueno, si nos vamos a cualquier libro de texto sobre Economía allí nos encontraremos las famosas curvas de la oferta y la demanda. Y según la teoría económica, si tu tienes una bajada en la demanda (menos pacientes enfermos igual a menos recetas) la oferta debe reaccionar produciéndose una bajada en los precios.

Las curvas de la oferta y la demanda. El precio de algo viene dado por el cruce de las dos. Si la demanda baja, la curva roja se desplaza hacia abajo y por lo tanto se produce un cruce a un precio inferior. Si disminuye la oferta (situación de monopolio), la curva azul se desplaza hacia la izquierda y por lo tanto el precio se incrementa.

En principio eso no debería suponer un problema para un medicamento cuya patente expiró y que se produce de manera genérica. Pero resulta que sí lo es si el precio de venta no empieza a cubrir los costes de producción. Se podía dar el caso de que un medicamento no se llegase a manufacturar porque resultase demasiado caro para tratar los pocos casos que hubiera. Esto no pasaba con el Daraprim pero sí que pasaba con otro tipo de medicamentos, sobre todo aquellos que se emplean para tratar enfermedades raras. En los Estados Unidos (y en otros países) una forma de evitar esa pérdida de empresas que manufacturasen medicamentos genéricos para enfermedades en vías de desaparición o raras fue crear una regulación del mercado que se conoce como "apadrinamiento" de un medicamento (medical drug grandfathering). La idea era la siguiente: si el medicamento está patentado entonces los derechos de exclusividad están ya reconocidos por 20 años desde la fecha del registro de la patente. Si el medicamento tiene la patente expirada y lo puede hacer cualquiera, pero es demasiado caro de producir lo que se permite entonces es una "exclusividad de mercado" durante el tiempo que estés produciendo ese medicamento de manera genérica.

Sin darse cuenta, con la "exclusividad de mercado" lo que los legisladores estadounidenses habían creado era una ley que favorece el monopolio, mucho más de lo que hace cualquier ley de patentes (además de otros problemas). Y eso es precisamente lo que ha aprovechado el codicioso de Martin Shkreli, director ejecutivo de Turing Pharmaceuticals. Compró los derechos de "exclusividad de mercado" en los EEUU para el Diraprim y entonces subió el precio hasta los 750$. Él lo ha justificado diciendo que invertirá las ganancias en el desarrollo de nuevos fármacos contra la malaria, pero creo que nadie le ha comprado esa burra vieja. De hecho la indignación de la sociedad estadounidense es tal que ya ha prometido que va a bajar el precio. Ya veremos como se sigue desarrollando el asunto. Sin embargo, esta historia de comprar los derechos de venta y luego subir los precios de medicamentos genéricos viene de lejos, lo que pasa es que Shrkreli se ha pasado de avaricioso.

El avaricioso más famoso. Fuente: Desmotivaciones.es

Esto ha tenido consecuencias inesperadas para las industrias biotecnológicas. Hillary Clinton ha aprovechado para hacer campaña y prometer una nueva legislación mucho más rigurosa con el precio de los productos de las compañías farmacéuticas si acaso llega al poder. Así que lo que ha pasado es que las acciones de todas las compañías biotecnológicas han bajado su valor de bolsa y se han perdido unos 40.000 millones de dólares en inversiones. Las compañías más afectadas han sido precisamente aquellas que estaban desarrollando medicamentos para enfermedades raras. Nadie va a invertir en algo si luego no puede recuperar dicha inversión con algún beneficio. Ciertamente la avaricia de Shrkeli ha roto el saco, pero desgraciadamente ha sido el saco de muchos



Pero también hay un lado bueno. Quizás no tenga nada que ver con la historia anterior, pero el pasado 25 de septiembre la compañía Novartis anunció el lanzamiento de un programa para que el precio de 15 medicamentos sea inferior a 1$ al mes si se venden en países en vías de desarrollo. No hay mal que por bien no venga

Otros enlaces donde ampliar la información:

• Market Exclusivity Is Sometimes Too Much
• Martin Shkreli Has One Idea, And It’s a Bad One 
• My Lunch With Shkreli: What We Should Learn From Pharma's Latest Monster 
• Hillary Clinton's $40 Billion Tweet Breaks Biotech Stocks -- Which 3 Got Hit Hardest?
• Drug pricing reform could be huge for big pharma — here is who has the most to lose

Este artículo participa en la L Edición del Carnaval de la Química organizado por la Asociación JEDA Granada.

Teixobactina: lo importante no es el pez, sino la red con la que se ha pescado.

Estructura de la teixobactina, un nuevo tipo de antibiótico. Fuente: Wikipedia

El descubrimiento de un nuevo antibiótico, la teixobactina, ha merecido la atención tanto de diversos medios de comunicación como de la blogosfera (Un par de ejemplos: Teixobactina, el “superantibiótico” de Bioamara, Teixobactina: algo más que el antibiótico del futuro, post de Ciencias y Cosas ). Sin desmerecer la importancia de dicho descubrimiento, a mí lo que me parece realmente importante no es el qué han descubierto, sino el cómo lo han descubierto. En ese sentido coincido más con el post A New Antibiotic That Resists Resistance de Ed Yong.

En este blog ya hemos hablado en numerosas ocasiones sobre el creciente problema de las resistencias a los antibióticos. Nombres como estafilococo MRSA, tuberculosis-XDR, Klebsiella NDM-1 empiezan a ser cada vez más comunes y temidos en los hospitales de todo el mundo. Las voces más pesimistas incluso hablan de que la sanidad pública podría volver a una situación similar a la de 1900, cuando no existía ningún tipo de sustancia antibiótica y padecer una infección podía significar una convalecencia larga e incluso la muerte.

Porcentaje de aislamiento de cepas resistentes de distintas especies bacterianas en los países europeos. Fuente ECDC

La mayor parte de los diferentes tipos de sustancias antibióticas fueron descubiertas entre los años 40 y 60 del pasado siglo. A partir de entonces cada vez ha sido más difícil encontrar alguna sustancia con utilidad terapéutica. No es que no sea sencillo encontrar una sustancia que mate a las bacterias. Lo difícil es encontrar una que mate a los patógenos pero que no afecte a nuestras células. En ese sentido la penicilina es el mejor ejemplo de un buen antibiótico. Lo que hace es inhibir la síntesis de peptidoglicano que forma la pared bacteriana. Y como nuestras células no poseen peptidoglicano no se ven afectadas por la penicilina. Es decir, un buen antibiótico inhibe o interfiere en un proceso vital exclusivo de las bacterias. Eso es lo que ocurre también con otros antibióticos como por ejemplo el cloranfenicol, la tetraciclina o la estreptomicina. En estos casos, esas moléculas inhiben la biosíntesis proteica mediante su unión al ribosoma y bloqueando el proceso de traducción. Como los ribosomas de las bacterias son algo diferentes a los ribosomas de nuestras células, esos antibióticos no nos afectan.

Esquema de los distintos sitios donde actúan los diferentes tipos de antibióticos que afectan a las bacterias. Actualmente existen resistencias frente a todos ellos. Fuente: Medical Reference Net

¿Cómo se vuelven resistentes las bacterias? Hay varios tipos de mecanismos. En el caso de la penicilina la resistencia suele ser debida a la producción de un tipo de enzima, las betalactamasas, que destruye al antibiótico. En otros casos lo que hace la bacteria es producir una proteína de membrana que expulsa al antibiótico del citoplasma. Y en otros lo que ocurre es que debido a una mutación se modifica el sitio de unión del antibiótico. Por ejemplo, si hay una mutación en algún componente del ribosoma, el antibiótico ya no puede unirse y no inhibe la traducción. El proceso de cómo la resistencia a un antibiótico se extiende entre las bacterias patógenas es uno de los mejores ejemplos de evolución darwiniana. El antibiótico elimina a las bacterias sensibles y sólo quedan las resistentes, que ahora tienen todo el hábitat para ellas solas. Este es uno de los motivos por los que nos estamos quedando sin antibióticos.

Algunos mecanismos de resistencia a los antibióticos. Las enzimas que inactivan a los antibióticos pueden hacerlo mediante su degradación o mediante una alteración química que evite que luego se una a su objetivo. estas enzimas pueden encontrarse en el exterior de la célula, como es el caso de las beta-lactamasas que destruyen a las penicilinas. Fuente: Encyclopaedia Britannica

Otro de los motivos ya lo hemos indicado antes. Es muy difícil encontrar una sustancia que mate bacterias y sea inocua para nosotros. Para determinar cual sustancia es válida y cual no, no sólo hay que encontrarla, hay que probarla. Y eso significa invertir dinero, mucho dinero, en experimentos y ensayos clínicos. Ese también es un problema, porque si una compañía farmacéutica invierte dinero en desarrollar un producto luego va a querer venderlo y sacar beneficio. Si el antibiótico no va a ser efectivo al cabo de poco tiempo debido a la aparición de resistencias, a lo mejor no le interesa nada investigar en ese campo ya que no va a cubrir la inversión dedicada al desarrollo del antibiótico (de sacar beneficios ni siquiera hablamos). Así que desarrollar nuevos antibióticos no parece que sea algo muy interesante para las compañías farmacéuticas.

Línea temporal del descubrimiento de las distintas clases de antibióticos. Fuente: Medscape. 

En esta gráfica se muestran tres tipos distintos de información. En primer lugar el número de compañías farmacéuticas que investigaban en antibióticos en 1990 (18 compañías) y las que quedaban en el 2011 (4 compañías). En segundo lugar, la cantidad de nuevos antibióticos aprobados para su uso (línea azul), y finalmente el porcentaje de aislamientos de cepas resistentes a los antibióticos. MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meticilina). VRA (Enterococcus resistente a vancomicina) y FQRP (Pseudomonas resistente a fluoroquinolonas). Fuente Nature.

Y sin embargo esos nuevos antibióticos son muy necesarios. Uno de los caminos que se está intentando es encontrar sustancias frente a las cuales la aparición de resistencias sea muy difícil. Pero encontrar dichas sustancias no es un camino de rosas. Los antibióticos son generalmente producidos por microorganismos que habitan en los suelos y este tipo de seres vivos no son nada fáciles de crecer en el laboratorio. De hecho se asume que en condiciones ideales solo se puede crecer a una especie de cada cien presentes en una muestra (en parte porque los microbiólogos hemos metido la pata durante 120 años). Así que quizás la sustancia que se busca sea producida por una de esas noventa y nueve especies que no crece. Se han intentado diferentes estrategias y tecnologías como por ejemplo la metagenómica para encontrar al menos los genes que producen dichos antibióticos.

Un iChip desenterrado del suelo donde se ha incubado. Fuente: Nature

Pues bien, el equipo de la compañía biotecnológica estadounidense NovoBiotic Pharmaceuticals liderado por el científico Kim Lewis de la Northeastern University de Boston, ha utilizado una tecnología que puede permitir crecer a esos microorganismos incultivables y poder así encontrar esos nuevos antibióticos. Se trata del iChip. Esta tecnología fue desarrollada en el año 2010 y ya se especulaba con que podría ser una herraienta muy eficaz para encontrar sustancias de interés biotecnológico, como así ha sido. El iChip consiste en unas micro-celdillas que contenían unas membranas semipermeables. Las microceldillas con las bacterias se enterraban en el suelo. De esa forma se podían introducir las bacterias para tenerlas en un entorno controlado, manteniéndolas al mismo tiempo en contacto con su ambiente natural para así disponer de cualquier factor de crecimiento que necesitaran y pudieran desarrollarse normalmente. Lo curioso es que las bacterias que crecen en el iChip luego pueden ser crecidas en el laboratorio a mayor escala. El iChip es como un paso previo de enriquecimiento. Así, han conseguido cultivar hasta un 50% de las bacterias presentes en la muestra.

Como funciona un iChip. Una muestra de suelo es diluida en agua y el iChip se sumerge en esa suspensión (a). La dilución asegura que en cada celdilla sólo haya un microorganismo (b). Después se ponen las membranas semipermeables en la parte superior e inferior (círculos transparentes) y estas son sujetadas gracias a un sistema de pinzado con tornillos (c). Una vez montado el iChip se entierra en el mismo suelo de donde se tomó la muestra. De esa forma los microorganismos estarán en el mismo ambiente de donde fueron recogidos y los factores de crecimiento o cualquier nutriente que requieran, podrá permear a través de las membranas y permitir que crezca el microorganismo. Pero como están encerrados en una celdilla, no se mezclarán entre si. En este enlace puedes ver un vídeo con una animación sobre el iChip. Fuente: Science 2.0

Crecer a las bacterias fue la primera parte, la segunda fue comprobar si producían un antibiótico. Para ello analizaron 10.000 cepas de bacterias, y comprobaron su actividad antimicrobiana frente a la bacteria Staphylococcus aureus MRSA. Así dieron con 25 especies que conseguían inhibir a la bacteria patógena. De ellas una, la bacteria Gram negativa Eleftheria terrae, producía un compuesto muy interesante y activo. Tan activo que Kim Lewis llegó a pensar que habían encontrado un detergente que simplemente destruía las membranas de cualquier tipo de célula. Pero afortunadamente no era así. El compuesto fue analizado y se comprobó que era un nuevo tipo de antibiótico. Ha sido bautizado como teixobactina (*). Se trata antibiótico peptídico, en concreto un depsipéptido macrocíclico. E. terrae lo biosintetiza mediante la condensación de una serie de D y L aminoácidos gracias a dos Peptido-Sintetasas no ribosómicas (eso no es tan raro, la penicilina es también un producto de una condensación de tres aminoácidos). La teixobactina ha mostrado actividad frente a otros patógenos como Clostridium difficile, causante de la colitis pseudomembranosa, Bacillus anthracis, que provoca el carbunco (aunque ahora le llamen ántrax), contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina, contra Streptococcus pneumonia resistente a penicilina y contra Mycobacterium tuberculosis. Incluso han probado en ratones que la teixobactina se puede usar exitósamente para combatir infecciones experimentales provocadas por S. aureus MRSA o por S. pneumoniae.

Infección experimental con S. aureus MRSA. Cada barra representa la supervivencia  tras 48 horas de un grupo de 6 ratones a los que se les inyectó una dosis letal de bacteria y posteriormente una dosis de antibiótico vancomicina o teixobactina (cantidades indicadas en el eje X). Nótese que con 0,5 mg/kg de teixobactina se consigue el 100% de supervivencia de los 6 ratones, mientras que con la vancomicina solo ha sobrevivido un ratón. Fuente: Ling et al. 2015 Nature.

Sin embargo, la propiedad más llamativa de la teixobactina es que parece ser un antibiótico contra el cual no va a ser fácil que se origine una resistencia. De hecho el título del artículo del Nature es el siguiente: A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance ¿Es eso posible o es una exageración?

En el artículo de Ed Yong se utiliza una frase de Leslie Orgel para dar respuesta a esa pregunta: La evolución es mucho más lista que tú. A largo plazo acabarán apareciendo microorganismos resistentes a la teixobactina. De hecho, ya los hay. Todas las bacterias Gram negativas son Son resistentes naturales a este nuevo antibiótico. Un ejemplo, la MIC de S. aureus es de 0,25 microgramos por mililitro mientras que la de E. coli es de 25. El motivo es que las Gram negativas tiene una membrana externa que impide que la teixobactina llegue al lugar donde ejerce su acción. La teixobactina es una molécula bastante grande, unas tres veces más grande que la penicilina para hacernos una idea, y quizás sea esa la razón por la que no puede atravesar esa membrana externa.

Estructura de la pared celular de las bacterias Gram positivas (izquierda) y las Gram negativas (derecha). La pared celular rodea a la membrana plasmática (plasma membrane). Ambas paredes contienen una capa de peptidoglicano, un polímero compuesto de un polisacárido lineal de acetil-glucosamina y acetil murámico, entrecruzado por cadenas de aminoácidos (el monómero se muestra en la parte inferior). Pero en las Gram negativas la capa de peptidoglicano está rodeada por una membrana externa (Outer lipid membrane). Otra diferencia entre ambas es que las capas de peptidoglicano de las Gram positivas está "reforzado" por largas cadenas de ácidos teicoicos (lipotheicoic acid). Fuente: Sigma-Aldrich.

Pero lo que se espera es que no suceda algo como lo que ocurrió con el linezolid, en el que un año después de haber sido aprobado ya se describieron las primeras resistencias. Las esperanzas es retrasar la aparición de esas resistencias el mayor tiempo posible. Algo similar a lo que ocurrió con la vancomicina. Dicho antibiótico fue descubierto en 1953 y hasta finales de la década de los 80 no se describieron las primeras cepas resistentes. La vancomicina y la teixobactina tienen algo en común: actúan sobre el mismo tipo de molécula inhibiendo la síntesis de la pared celular de las bacterias. Ambas se unen a un precursor de la pared celular denominado lipido II. Pero además, la teixobactina también se une a otro precursor denominado lípido III. Vamos a intentar explicar su acción con una analogía que ya he utilizado anteriormente. Podemos imaginar que la pared de una Gram positiva es como un muro de hormigón armado. El peptidoglicano sería el cemento y los ácidos teicoicos serían las varillas de acero. Siguiendo con la analogía, las fábricas que hacen el cemento y las varillas está en el citoplasma de la bacteria. Pero la pared está en el exterior de la célula, así que esos componentes deben de ser transportados allí, y una vez fuera, es donde polimerizan (donde fraguan por seguir con el símil).

Mecanismo de actuación de la teixobactina. Clikear para ampliar. A la izquierda se representa une esquema de la bacteria Gram negativa Eleftheria terrae secretando el antibiótico y éste uníéndose a las moléculas objetivo (rectángulo con la palabra TEIX). A la derecha tenemos una visión ampliada del mecanismo de acción sobre el lípido II y el lípido III que se encuentran localizados en la membrana plasmática. El interior celular estaría en la parte inferior y el exterior en la superior. En el esquema representan de manera simplificada los pasos de síntesis de los monómeros que formarán el peptidoglicano (hexágonos azules y verdes) y de los monómeros que formarán los ácidos teicoicos (elipses rojas y azules).  También se muestra el sitio de unión de la vancomicina (rectángulo rojo), que aunque afecte a la misma molécula, lo hace en un lugar diferente. Fuente: Sci-news.com 

Queda claro que los componentes del muro deben de atravesar la membrana celular. Pues bien, las moléculas responsables del traslado desde el citoplasma al exterior de la membrana son el lípido II y el lípido III. Continuando con la analogía son como unos camiones de transporte, el lípido II sería una hormigonera porque lleva el precursor del peptidoglicano y el lípido III es un trailer con el precursor del ácido teicóico. La teixobactina se une a esos lípidos y evita el transporte. Digamos que destruye los camiones que llevan el material de construcción. Esa especificidad en actuar sobre ese tipo de moléculas es lo que hace pensar que no va a ser fácil que se desarrollen mecanismos de resistencia frente a la teixobactina. Voy a intentar explicarlo desde lo que yo considero el mecanismo más improbable a lo más probable:

• Bombas de expulsión del antibiótico. La teixobactina actúa en el exterior de la célula, no en su interior, así que este tipo de resistencia no puede darse. Es una típica resistencia para antibióticos que inhiben la síntesis proteica.


• Resistencia por alteración de la diana por mutación genética. Muy improbable. Un ejemplo lo tenemos en algunos resistentes a la penicilina. Los beta-lactámicos actúan mediante su unión al centro activo de la enzima que polimeriza el peptidoglicano. Si sucede una mutación que afecta a la estructura del centro activo de forma que evita que se una la penicilina ya tenemos un resistente. Pero un lípido no puede modificarse por una mutación genética como le puede ocurrir al centro activo de una enzima. 


• Resistencia por alteración de la ruta metabólica Muy improbable. El ejemplo son los resistentes a las sulfonamidas, antibióticos que inhiben la ruta de síntesis del ácido fólico. Lo que hacen las cepas resistentes es tomar el fólico del hospedador. La ruta de síntesis del peptidoglicano es una de las más conservadas en todo el dominio Bacteria. Además la teixobactina actúa sobre un transportador, no sobre una enzima metabólica. 


• Resistencia por entrada alterada Poco probable. Como hemos visto la pared celular de los Gram negativos tiene una membrana externa que impide que la teixobactina llegue a la membrana plasmática. En los Gram positivos no existe esa membrana, sin embargo es cierto que algunos de ellos presentan cápsulas polisacarídicas a veces extraordinariamente complejas, como es el caso de las micobacterias, y quizás podría darse ese caso. Pero que yo sepa no ha sido descrito un mecanismo de este tipo en Gram positivos 


• Alteración enzimática de la diana Poco probable. Este es el mecanismo de resistencia a la vancomicina. Si nos fijamos en la figura anterior donde se señála el lugar de acción de la teixobactina y de la vancomicina sobre el lípido II veremos que es algo distinto. La vancomicina se une a la cola de aminoácidos unidos al disacarido de acetil-glucosamina y acetil murámico,(el monómero del peptidoglicano). En la resistencia a la vancomicina hay unas enzimas (VanA, B y C) que modifican algo las cargas de ese monómero, de manera que la vancomicina no se une, pero el monómero puede ser usado en la polimerización del peptidoglicano. La teixobactina se une a la cabeza polar del lípido transportador. Si se modifica dicha cabeza a lo mejor la teixobactina ya no se une, pero a lo mejor el lípido ya no puede cumplir su función. 


• Degradación o alteración enzimática del antibiótico La más probable en mi opinión. Es el caso de las betalactamasas que destruyen a las penicilinas. Como se ha señalado antes la teixobactina es un depsipéptido macrocíclico, pero no deja de ser un péptido. Y las actividades enzimáticas que destruyen los enlaces peptídicos son muy frecuentes en la naturaleza. De hecho, una de las críticas que se ha hecho al trabajo ha sido la de no comprobar si había resistentes a la teixobactina en el mismo suelo de donde partió la muestra. Normalmente si encuentras un antibiótico en un sitio, encuentras al resistente en el mismo lugar.

Esperemos que efectivamente no les sea fácil desarrollar resistencias contra la teixobactina a las bacterias patógenas sensibles a ella. Como ya hemos dicho en otras ocasiones, la humanidad necesita nuevos antibióticos.



(*) En inglés teixobactin se pronuncia Tayco-back-tin, y es una referencia a "adelgazar a los ácidos teicoicos". El nombre de Eleftheria terrae significa "libre de la tierra" y hace referencia a la manera en que ha sido cultivada gracias al iChip.


Esta entrada participa en la XLIII edición del Carnaval de la Química alojado en el blog La Ciencia de la Vida

La revolución CRISPR/Cas

Ni CRISPR es el nombre de una nueva marca de aperitivo crujiente ni Cas es el nombre de un refresco para acompañarlo. La primera palabreja es el acrónimo de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que en español significa "Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas". La segunda es el nombre de una serie de proteínas, principalmente unas nucleasas, que las llamaron así por CRISPR associated genes (es decir: "genes asociados a CRISPR". No se rompieron la cabeza). Dicho así tampoco es que se aclaren mucho las cosas ¿no? Y sin embargo es posible que estemos contemplando el desarrollo de una tecnología genética que va a suponer una auténtica revolución comparable a la que supuso la famosa PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para las Ciencias Biológicas.

Vamos intentar describir lo que es CRISPR/Cas en una sola frase: es el sistema inmune de las bacterias. ¡Espere! No deje de leer todavía. No es tan descabellado como parece. En los vertebrados, incluidos los seres humanos, el sistema inmune es el conjunto de células y órganos encargados de defender al organismo de las infecciones provocadas por bacterias o virus. No es exclusivo de los vertebrados, ya que otro tipo de animales como los insectos, crustáceos, moluscos, incluso esponjas, también tienen un sistema inmune, aunque mucho más simple. Pero las bacterias son seres unicelulares, entonces ¿cómo puede tener una bacteria un "sistema inmune"?

Las bacterias también pueden ser infectadas, por ejemplo por virus. Ya hemos comentado en otros artículos anteriores que un virus es un pirata de la célula. Los virus que infectan bacterias son llamados bacteriófagos, o simplemente fagos. Los más simples están compuestos de un ácido nucleico que puede ser DNA o RNA como material genético, y de una envoltura proteica denominada cápside. De manera muy simple el ciclo biológico de un fago es el siguiente: el virus se une a la bacteria gracias a su cápside y le inyecta su ácido nucleico. Una vez dentro el ácido nucleico viral toma el control de las funciones celulares, sobre todo del proceso de biosíntesis de proteínas. A partir de ese momento, la bacteria sólo replica el material genético viral y sintetiza proteínas virales. Según se van acumulando en el interior de la célula se van ensamblando los nuevos virus, hasta que al final la bacteria revienta (se lisa) y los nuevos virus son liberados.

Ciclo lítico de un fago. Origen de la imagen: Biología Médica

Está claro que a una bacteria le interesaría tener alguna forma de neutralizar a un virus que se mete en su interior (o cualquier otro DNA extraño, como el de un plásmido). Una forma de hacerlo es tener unas enzimas que sean capaces de distinguir entre el material genético de la bacteria y entre el material genético vírico, y una vez hecha la distinción, destruir al material genético del virus. Esas enzimas se descubrieron en la segunda mitad del siglo XX y se le conoce como el sistema de restricción/modificación: las que destruyen el DNA foráneo se las denomina enzimas de restricción, y las que reconocen y modifican el DNA propio para que no sea destruido se las llama enzimas de modificación. Las primeras sobre todo son una de las herramientas más importantes dentro de la ingeniería genética. Pero hay otra forma de neutralizar a un virus que infecta a una bacteria: el sistema CRISPR/Cas.

La historia tuvo su origen cuando se comenzó a mapear los genomas completos de bacterias y otros microorganismos. Se esperaba que unos seres vivos tan pequeños tuvieran su información genética muy compactada en el DNA. Y en general es así. Pero también había sorpresas (sorpresas que fueron descifradas por el microbiólogo Francis Mojica). Una zona del genoma de muchos microorganismos, sobre todo arqueas, estaba llena de unas secuencias que parecían repeticiones palindrómicas sin ninguna función aparente. Estas repeticiones estaban separadas entre si mediante unas secuencias denominadas "espaciadores" que se asemejaban a secuencias encontradas en virus y en plásmidos. Justo delante de esas repeticiones y "espaciadores" hay una secuencia que se la denomina "líder". Muy cerca de este agrupamiento se podían encontrar unos genes que codificaban para un tipo de nucleasas: los genes cas.

Estructura del locus CRISPR(A) Las secuencias repetidas de unos 32 pares de bases (gris oscuro) están intercaladas por las secuencias "espaciadoras" (colorines). El número de estas secuencias puede variar enormemente entre diferentes cepas bacterianas de la misma especie.(B) La secuencia conservda "líder" (en gris claro) de unos cuantos cientos de pares de bases está delante del agrupamiento de repeticiones y espaciadores (C) Los genes cas están cercanos al locus CRISPR. Se muestran la estructura de dicho locus en tres especies bacterianas como ejemplo. Fuente de la imagen: Karginov FV y Hannon GJ. Mol Cell 2010

Vamos a intentar explicar esta situación con una analogía. Supongamos que el genoma de la bacteria es como un libro de instrucciones. Imaginemos que ese libro se titula "Haga una Escherichia coli en 1000 fáciles lecciones". Las secuencias CRISPR sería como encontrar 50 páginas en las que sólo leyéramos decenas de frases palindrómicas como estas: "Daba la zorra arroz al abad", "¿Acaso hubo búhos acá?", "La ruta nos aportó otro paso natural", y esas frases separadas entre sí por una serie de textos que parecerían sacados de otros libros titulados "Cómo hacer un fago" o "Cómo hacer un plásmido". A primera vista pensaríamos que esas páginas contienen información sin sentido y que se trata de un error de imprenta. Pero si encontráramos que todos los ejemplares de otros libros dedicados a Streptococcus pyogenes o Pyrococcus furiosus contienen ese mismo tipo de páginas, entonces empezaríamos a pensar que deberían servir para algo.

Volvamos a los virus. Como hemos dicho antes esos seres son piratas de la célula. Siguiendo con la analogía del libro, un virus sería como una página suelta que si es capaz de integrarse en un libro, entonces se fotocopia de manera que acaba ocupando todas las páginas de ese libro. Es como si pusiéramos dentro de un ejemplar de "El Quijote" una página de las memorias de Belén Esteban y al final en lugar de la obra de Cervantes acabamos con un tocho de hojas de la teletertuliana. Pues bien, si esa página-virus se integra en un libro que contiene las páginas de palíndromos lo que observaríamos es que esa página-virus no se fotocopia, sino que es destruida. Son precisamente esas páginas que no parecen tener sentido las encargadas de dicha protección.

De manera muy simplificada, a nivel molecular lo que está ocurriendo es lo siguiente. Cuando el material genético del virus entra dentro de la bacteria debe de tomar el control de la maquinaria celular y para ello empieza a interaccionar con diversos componentes celulares. Pero puede darse el caso que interaccione con un complejo formado por una proteína Cas unida al RNA producido a partir de las secuencias CRISPR. Si ocurre eso, resulta que el material genético viral es inactivado y posteriormente degradado. Pero el asunto no se queda ahí. Las proteínas Cas hacen otra cosa además de destruir el material genético del virus. Resulta que son capaces de tomar una pequeña parte del DNA viral, modificarlo e integrarlo dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esa forma, si esa bacteria o su descendencia se encuentra con ese mismo virus, ahora inactivará de forma mucho más eficiente al material genético viral.

Funcionamiento del sistema CRISPR/Cas. Un virus ha introducido su DNA en la bacteria. A ese DNA se le ha unido un complejo que consiste en un tipo de proteína Cas (verde) que lleva unido un pequeño crRNA ("cr" por CRISPR). Esa unión inactiva al DNA viral y así puede ser degradado. El pequeño crRNA proviene del procesamiento de un crRNA de mayor tamaño por parte de otro tipo de proteína Cas (azul). Ese RNA es el producto de la transcripción de todas las secuencias CRISPR presentes en el genoma de la bacteria. En paralelo a la inactivación del DNA viral, otro tipo de proteínas Cas (rojo) reconocen al DNA viral y a partir de él crean un pequeño segmento que integraran en las secuencias CRISPR, de esa forma la bacteria formará complejos crRNA/Cas mucho más eficientes en su unión al DNA viral en caso de una nueva infección por el mismo virus. Imagen realizada a parir de material de la Wikipedia y del artículo Karginov FV y Hannon GJ. Mol Cell 2010 .

Recapitulemos. El llamado "sistema inmune de las bacterias" es simplemente un mecanismo por el cual se reconoce genoma viral, se inactiva y se destruye, al mismo tiempo que una parte de ese genoma viral se incorpora al genoma de la bacteria para así generar una protección más eficiente. Esto es el típico resultado de lo que llamamos Ciencia Básica. La humanidad ha adquirido un nuevo avance en el conocimiento sobre cómo funciona el mundo. ¡Bravo! ¡Estupendo! Pero, y esto, ¿para qué sirve?

Esa es la típica pregunta que se hace cualquier miembro de la sociedad. Y como científicos no debemos olvidar que lo que hacemos suele estar pagado con los impuestos del sufrido ciudadano, así que hay que rendirles cuentas y demostrarles que el conocimiento en ciencia básica puede que no tenga una aplicación útil inmediata, pero que la puede tener en el futuro, y ser tan importante que cambie por completo sus vidas y la de sus hijos. Eso es lo que sucedió antes con la internet, con el horno microondas y con los test para detectar enfermedades genéticas. Y también está pasando con el sistema CRISPR/Cas.

Como hemos visto antes, una de las cosas que hace el sistema CRISPR/Cas es introducir DNA de un organismo, el virus, en el DNA de otro organismo, la bacteria. Y lo hace con una precisión absoluta. Es el mejor sistema que conocemos para realizar esa integración. En relación con los sistemas anteriores que se utilizaban en ingeniería genética sería como comparar un serrucho con una sierra eléctrica. No es de extrañar que la revista Nature le dedicara una portada a la proteína Cas9 (puede verse arriba) ¿Y este sistema no podría usarse con otros organismos? Pues la respuesta es sí. El sistema CRISPR/Cas puede ser utilizado para introducir cualquier tipo de DNA en el DNA de cualquier tipo de ser vivo, sean estos bacterias, setas, plantas, insectos, peces, ratones, monos e incluso seres humanos (esto último aún no se ha hecho). Es decir, el sistema CRISPR/cas va camino de convertirse en una herramienta que nos va a permitir por ejemplo hacer terapia génica con gran precisión y así tratar enfermedades como la hemofilia o la enfermedad de Huntington.

Funcionamiento de la enzima Cas9. Esta nucleasa tien dos sitios activos que pueden romper cada una de las cadenas de una doble hélice de DNA. La enzima es guiada a una secuencia concreta de DNA que queremos cortar gracias a unas secuencias denominadas PAM (por las siglas en inglés de motivos adyacentes a los protoespaciadores) y que pueden ser sintetizadas a medida en el laboratorio. La molécula de DNA puede ser vuelta a ligar gracias a los sistemas de reparación. Pero si hay presente un DNA dondador homólogo a la secuencia que ha sido cortada entonces puede introducirse por recombinación homóloga y de esa forma realizar un inserción genética dirigida tanto en bacterias, líneas célulares de mamíferos, o embriones de pez zebra. Origen de la imagen: Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Doudna. Nature 2013.

Y los primero pasos ya se han dado. El Instituto Technológico de Massachuset anunció el pasado 30 de marzo que había conseguido curar a un ratón adulto de una enfermedad hepática de carácter genético utilizando el sistema CRISPR/Cas. Los ratones estaban afectados de tirosinemia de tipo I, una enfermedad en el que el gen que codifica la que la enzima fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH) no funciona por una mutación. Esta enzima se encuentra en los hepatocitos, las células del hígado, y si no funciona entonces el aminoácido tirosina no se degrada correctamente por lo que se acumula fumarilacetoacetato, lo que acaba causando fallos en el hígado y en los riñones. Esta enfermedad también se da en humanos, su incidencia es de 1 entre 100.000 nacimientos y puede provocar retraso mental, problemas hepáticos graves e incluso la muerte. Hay un tratamiento paliativo a base de una dieta baja en proteínas y administrando nitisinona. Otra posibilidad es realizar un trasplante hepático.

Lo que hicieron los investigadores fue inyectar en una vena de los ratones a la proteína Cas-9 con un segmento de RNA unido a otro pequeño segmento de DNA. La función del segmento de RNA es indicar a la proteína Cas-9 dónde tenía que cortar en el gen FAH dentro del genoma de las células de ratón. La función del segmento de DNA era integrarse en ese gen y sustituir la mutación deletérea por la secuencia correcta del gen FAH. La inserción y sustitución sólo funcionó en 1 de cada 250 hepatocitos, pero esas células ya eran normales y sanas. Y mientras las portadoras de la mutación se morían por el acúmulo de fumarilacetoacetato, las sanas las iban remplazando. En 30 días un tercio de todas las células de los hígados de los ratones tratados eran células curadas y los roedores podían sobrevivir sin tratamiento.

Los ratones Fah^mut/mut portan una mutación homocigótica en la que una Guanina ha sido sustituida por una Adenina en el último nucleótido del exon 8. Esta mutación causa que el exon 8 sea removido durante el procesamiento del mRNA del gen Fah lo que da lugar a una proteína totalmente inactiva (representado por los segmentos debajo de la secuencia). Lo que se hace es inyectar proteína Cas9 junto con un crRNA diseñado para ser dirigido al lugar donde está la mutación y un DNA de cadena sencilla (ssDNA) que porta la secuencia correcta. En las microfotografías de la parte inferior puede verse una tinción de hematoxilina-eosina (H&E) de secciones del hígado provenientes de ratones tratados después de 30 días. Al la izquierda se ve la de un ratón sin la mutación (Fah^+/+, un ratón Fah^mut/mut al que se le ha inyectado ssDNa y Cas9 sin el crARN-guía y el , y un ratón Fah^mut/mut al que se le ha inyectado ssDNA y Cas9 con el crRNA-guía. En las microfotografías superiores la barra representa 100 μm y en las inferiores 20 μm . Nótese la aparición de células sanas que aparecen en el ratón tratado con Cas9 guiado. Fuente de la imagen: Yin et al. Nature Biotechnology 2014.

Este es sólo un ejemplo de los muchos trabajos que se están realizando con este sistema. Según la revista Nature Biotechnology, en el último año y medio se han publicado más de 125 artículos científicos y se han fundado tres compañías biotecnológicas dedicadas a comercializar y mejorar este sistema. El último mes, las Universidades de California de San Francisco (UCSF) y de Berkeley (UCB), y la Fundación Li Ka Shing habían invertido 12 millones de dólares en la creación de la Iniciativa de Innovación Genómica (IGI) dedicada a acelerar la adopción de esta tecnología. No está mal como aplicación de un descubrimiento de Ciencia Básica realizado en bacterias en el año 1987.

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Karginov, F., & Hannon, G. (2010). The CRISPR System: Small RNA-Guided Defense in Bacteria and Archaea Molecular Cell, 37 (1), 7-19 DOI: 10.1016/j.molcel.2009.12.033

Shen, H. (2013). CRISPR technology leaps from lab to industry Nature DOI: 10.1038/nature.2013.14299

Charpentier, E., & Doudna, J. (2013). Biotechnology: Rewriting a genome Nature, 495 (7439), 50-51 DOI: 10.1038/495050a

Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R., Benedetti, E., Grompe, M., Koteliansky, V., Sharp, P., Jacks, T., & Anderson, D. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype Nature Biotechnology DOI: 10.1038/nbt.2884